成果報告書詳細
管理番号20140000000312
タイトル平成22年度-平成25年度成果報告書 「ヒト幹細胞産業応用促進基盤技術開発 ヒト幹細胞実用化に向けた評価基盤技術の開発」(浜松ホトニクス株式会社)
公開日2014/8/8
報告書年度2010 - 2013
委託先名浜松ホトニクス株式会社
プロジェクト番号P10027
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約増殖させたヒト幹細胞の状態と特性を評価検定し、理想的な状態の標準的なヒト幹細胞を供給するため、経時的に連続して培養増殖中のヒト幹細胞をモニターし、細胞の状態変化や自発的分化細胞の出現などの培養中の不具合を素早く検出することを可能とするイメージング技術による生細胞検査技術の開発に取り組んだ。
 具体的には、標準的な方法で培養された最適な状態のヒト幹細胞、それと比較するために分化細胞が一部出現したような非最適なヒト幹細胞などを検体として、多パラメータ観察技術によるイメージングデータを取得し、比較することによって両者を判別するためのイメージング技術を開発した。ヒト幹細胞集団(コロニー)は2次元平面的なプロファイルのみならず、立体的な特徴を有し、コロニーの良し悪しを判定するには2次元平面的なプロファイルだけでは不十分である。そこで、培養された状態でヒトES細胞コロニーの多面的な形態を定量的に測定することができる顕微鏡をベースとしたヒトES細胞イメージング装置(以下イメージング装置)の試作開発を実施した。われわれは細胞の光学特性を定量的に求めることができる光干渉計測技術に着目し、光学的位相の定量的なイメージング技術(定量位相顕微鏡法)をヒトES細胞コロニーのイメージングに応用し、培養状態のヒトES細胞コロニーに照射した光の位相変化を顕微鏡レベルで定量的に画像化することにより、2次元的な特徴、たとえばコロニーの周長、面積などのみならず、光学的な厚さや、さらに接着状態などの多パラメータの時間的空間的な変化を取得できるようにした。
完成したイメージング装置試作機を用いて最適な状態のヒトES細胞コロニーと分化細胞が出現したヒトES細胞コロニーを培養下で生きたままイメージングを行った。2次元的な特徴、光学的な厚さ、接着状態などのパラメータ、時間的な変化を数値化して、その結果を既存の品質指標や分化マーカーと比較し、分析をすることで細胞状態を評価する候補パラメータを選定した。1つの細胞株で得られた分析を別の細胞株についても同様に行い、合計4つの細胞株に対し分析を行い、その結果を既存の品質指標や分化マーカーと比較した結果、細胞状態を評価する候補パラメータを選定することができた。また、培養初期の細胞数の少ない段階でも評価を行い、同様のパラメータで細胞状態を評価できることも示唆された。
委託事業における成果は、光イメージング技術による未分化細胞と分化誘導した細胞の検査技術と評価パラメータの選定である
英文要約The aim of this NEDO (New Energy and Industrial Technology Development Organization) Project is the “Development of Core Technologies for Industrial Applications of Human Stem Cells”. In recent years, great progress has been made worldwide in developing drug discovery screening and cell therapy applications for hPSCs (human pluripotent stem cells, such as hES cells).However, large scale PSC culture methods vary widely across the globe, and are in need of standardization. Initiated last year in Japan, this six-year national project supported by METI (the Ministry of Economy, Trade and Industry) aims to develop not only large scale production methods, but also the technologies necessary for stem cell evaluation.

1.4 Development of robust, mass culture and cryo-preservation technologies for hPSC lines
Multi-parameter imaging technology for living cell in the culturing.

When we make human hES cells proliferate to obtain a large amount of hES cells with high quality, the continuous monitoring of the quality of the cells in culture with non-invasive manner is needed. We have been developing a novel optical microscope-based method to evaluate the quality of cultured cells continuously using various morphological and optical parameters of the cells in culture. We constructed the prototype of the microscope-based imaging system that obtains to obtain various optical parameters of living cells in culture. Using this microscope system, we measured the optical parameters, which is thought to reflect the structural features of the cells, of various differentiated adult cells such as fibroblasts, hepatocytes, brown adipocytes, and microvascular endothelial cells. When comparing the optical parameters in various cell types, we found that each cell type shows the different distinctive characteristic in the optical parameters. Next, we measured optical parameters of hES cells in the good and the bad culture conditions. We have tested 4 cell lines and compared to the stem cell markers. We found the characteristic pattern of optical parameters that distinguishes between cells in the good and in the bad culture conditions. Our results suggest that the optical parameter, which can be obtained with non-invasive manner, is one of the reliable indexes to evaluate the quality of hES cells.
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