成果報告書詳細
管理番号20140000000460
タイトル平成24年度-25年度成果報告書 「ヒト幹細胞産業応用促進基盤技術開発 ヒト幹細胞実用化に向けた評価基盤技術の開発」(国立大学法人大阪大学 幹細胞評価基盤技術研究組合)
公開日2014/8/21
報告書年度2012 - 2013
委託先名国立大学法人大阪大学 幹細胞評価基盤技術研究組合
プロジェクト番号P10027
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約(1) 研究開発項目1「ヒト幹細胞の安定な培養・保存技術の開発」
1-1.安定した培養に必要な自動培養装置、凍結保存装置の開発
 自動培養装置では、フィーダー細胞使用、および、フィーダーフリーでiPS細胞を自動培養する技術を開発し、自動培養試験を実施した。また、凍結保存装置と細胞観察装置との連携を目指し、連携機能の開発を行い、前者は連携試験を実施した。
 全自動凍結保存装置では予備凍結機能を最適化開発してヒトiPS細胞解凍後の生細胞率を平均で80%以上とした。またフィーダー細胞による培養で自動培養装置と結合して予備凍結、凍結保存、解凍から再培養への一連の全自動処理を達成した。更に市場ニーズに応えるために全自動凍結保存装置の高収納化に目途をつけた。
 細胞観察装置では、iPS細胞の培養工程中のコロニーの輪郭形状や明瞭性、面積、細胞密度、などの形態特徴量を数値化し、分化した細胞形態を認識するヒト幹細胞画像評価ソフトのプログラムの開発・検証を行い、未分化/分化の判定技術を開発した。また、非侵襲3次元観察技術の試作品開発を実施した。
1-2.幹細胞の安定供給に最適化した培養基材および培地の開発
 培養基材では、改良型ラミニン活性フラグメントのプロトタイプを作製し、その有用性を検証した。また、乾燥によるラミニンフラグメントの失活を抑制する物質を同定し、長期保存可能なプレコート品の製造に目処をつけた。
 培地の開発では、自動培養装置やラミニン活性フラグメントとの相性から効果的な候補培地を選定した。開発評価用iPS細胞統一ロットストックを作製し評価がより安定して行えることになった。凍結保存液では、フィーダー細胞使用、および、フィーダーフリーで培養したヒトiPS細胞において全自動凍結保存及び解凍が可能である市販のES細胞用凍結培地を選定して、全自動凍結・解凍装置による簡便な緩慢法によるヒトiPS細胞の凍結保存を可能とした。
1-3.間葉系幹細胞の品質管理・安定供給技術の開発
 複数種間葉系幹細胞に対して血清および無血清培地による細胞増殖能や分化能などの基盤データの集積および網羅的遺伝子発現解析とレクチンマイクロアレイ解析の取得と細胞の基盤データに基づいたバイオインフォマティクス解析を行い、各種間葉系幹細胞の増殖能と分化能に相応するバイオマーカーの候補を複数見出した。これらを元に間葉系幹細胞の品質管理カタログを提示し、さらなる検証を進めた。また見出したマーカー候補の特許調査も行った。間葉系幹細胞の臨床研究の世界的動向についての市場調査を実施した。

(2) 研究開発項目2「ヒト幹細胞の品質管理・安定供給技術の開発」
2-1. ヒトiPS細胞に係る技術等の標準化案の策定
 ヒトiPS細胞を含む幹細胞種と加工・製造に係る用語の定義(ISO規格原案)、およびヒトiPS細胞株のin vitro自動拡大培養技術の標準化案(ISO規格草案)を作成した。また、FIRMと連携して、学会、大学、産業界、府省関係者の参画による常設の国内審議体制及びISO/TC276(暫定名称:Biotechnology)国際提案体制を構築した。
英文要約(1) Research item 1: The development of the technology of stable cultivation and preservation of human stem cells
1-1. The development of an automatic cell processing and freezing preservation machine for the stable cultivation
As for the automatic cell processing machine, we developed a technology to culture iPS cells automatically with and without feeder cells and conducted its validation test with the automatic cell culture machine. In pursuit of cooperation with a freezing preservation machine and a cell observation machine, we developed their functions and validated a cooperation test between the freezing preservation machine and the automatic cell processing machine.
As for the automatic freezing preservation machine, we developed an optimum pre-freezing function, with which post-thaw viability of human iPS cells increased to more than 80% on average. By combining the automatic cell processing machine and the automatic freezing preservation machine, we achieved full automatic feeder cell processing: from pre-freezing, freezing preservation, and thawing through re-culture. For meeting further market needs, we are working to increase storage capacity in the automatic freezing preservation machine and will be able to achieve it soon.
As for the cell observation machine, we developed and validated an image assessment software program for human stem cells, which quantifies morphological characteristics, such as shapes of colonies, their clarity, dimensions, cell count, etc., and recognizes differentiated cell morphology. With the software program, we developed a technology to judge whether cells are undifferentiated or differentiated. We also developed a prototype of a cell observation machine with minimally invasive 3D observation technology.

1-2. The development of the culture substrates and medium optimized for stable cultivation of stem cells
 As for culture substrates, we developed a prototype of an improved laminin active fragment and validated its effectiveness. We identified a substance that protects laminin fragments from inactivation due to drying and paved the way for production of laminin fragment-precoated culture vessels that can be stored for long period.
As for developing media, we selected effective candidate media, considering compatibility with the automatic cell processing machine and laminin active fragment. More stable evaluation became available by making and stocking common media in lots, which can be used for iPS cells for development evaluation. As for cryopreservation media, we selected commercial ES cell cryopreservation media, which also can be used in automatic cryopreservation and thaw of human iPS cells cultured from feeder cells and feeder-free cells. As a result, slow cryopreservation of human iPS cells became available with the automatic freezing/thawing machine.

1-3. The development of the technology of quality control and stable cultivation of mesenchymal stem cells
 We collected biological data on several types of mesenchymal stem cells, such as their cellular proliferation abilities, differentiation abilities, etc., using serum media and serum-free media. Based on these data, we conducted global gene expression analysis, lectin microarray analysis, and bioinformatics analysis. As a result, we successfully identified several candidate biomarkers that indicate proliferation abilities and differentiation abilities found in several types of mesenchymal stem cells. We presented quality control catalogues based on them and conducted further validations. We also conducted patent search for the candidate biomarkers. Moreover, we conducted market research on global trend in clinical research on mesenchymal stem cells.

(2) Research item 2: The development of the technology of quality control and stable cultivation of human stem cells
2-1. Proposal of draft standards of technologies around human iPS cells
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