成果報告書詳細
管理番号20140000000727
タイトル*平成25年度中間年報 「バイオマスエネルギー技術研究開発 バイオ燃料製造の有用要素技術開発事業 バイオ燃料事業化に向けた革新的糖化酵素工業生産菌の創製と糖化酵素の生産技術開発
公開日2014/12/6
報告書年度2013 - 2013
委託先名花王株式会社 国立大学法人長岡技術科学大学 一般財団法人バイオインダストリー協会
プロジェクト番号P13011
部署名新エネルギー部
和文要約件名;平成25年度分中間年報「バイオマスエネルギー技術研究開発 バイオ燃料製造の有用要素技術開発事業バイオ燃料事業化に向けた革新的糖化酵素工業生産菌の創製と糖化酵素の生産技術開発」
 
 本事業は、「バイオ燃料技術革新計画」の技術革新ケースのベンチマークであるエタノールコスト40円/L-EtOHの達成(2015-2020年)によるバイオマスエネルギー普及を目指し、2020年までに、セルロース系バイオマスを原料とするエタノール生産の酵素糖化プロセスを商用機スケールで可能とするため、糖化能力 1 mg/g-生成糖以下を持ち、酵素コスト 4 円/L-EtOH で酵素を提供できるプロセス技術パッケージの開発を行う。上記ベンチマーク達成を目指し、研究開発項目として1)糖化酵素の高機能化、2)糖化酵素の工業用生産菌の構築、3)糖化酵素の安価な大量生産技術の開発を実施する。平成25年度は、以下に示した研究成果を得ることができた。
1)糖化酵素の高機能化
本年度は、高機能酵素の探索、改変に必要な培養条件や解析方法の確立に取り組んだ。
高機能酵素の探索において、各酵素とも候補遺伝子の探索を行い、一部遺伝子についてはクローニングを開始した。また、高機能酵素の改変のためラショナルデザイン手法並びに進化分子工学的手法を用いたスクリーニング系の構築を行った。低酵素量使用時の糖化反応停止現象が高効率糖化の障害になっていることから、非生産的及び非特異的吸着現象の解析を行うため、バイオマス基質と成分酵素間のインターラクション解析を開始した。
2)糖化酵素の工業用生産菌の構築
 T. reeseiには、アスペルギルス属にみられる炭素源異化抑制に関与する因子の相同因子として、CreA(Cre1のホモログ)以外にCreB、CreC、CreDが存在していた。そこで、転写因子の制御によるセルラーゼ生産の誘導を行うため、各転写相同因子の破壊株の作成を開始した。糖化酵素生産菌の生産性増強のため、工業用生産菌の開発ベース株の選抜を試みた。評価した菌株は、第一世代高機能糖化酵素生産菌の親株であるPC-3-7株と、その変異株で酵素生産性が高いとされるPCD-10株およびCDU-11株を用いた。各株の分泌タンパク質の生産性をジャーファーメンターにて確認した結果、PCD-10では、PC-3-7と比べて培養液1Lあたりのタンパク質分泌量が20%向上していた。また、CDU-11では、PC-3-7と同等の生産性を示した。今後、組換えPCD-10株およびCDU-11株を用いて糖化酵素の生産性を検討し、工業用生産菌創製に最適な宿主菌を選抜する予定である。
3)糖化酵素の安価な大量生産技術の開発
 コスト低減に向けて安価な炭素源の探索を行い、アルカリ処理の草本系バイオマス、加工品パルプについて利用の可能性を見出した。また、酵素生産の最適化を目的とし、培養挙動解析に着手した。排ガス分析から培地成分の炭素源の配分、菌体定量測定器による菌体生育状況の経時的変化、培養上清中のアンモニア、リン濃度の変化と酵素生産性への影響など培養挙動解析から、今まで不透明であった菌体増殖と酵素生産のおおまかな全体像をとらえることができた。
 工業化技術確立の中で重要なスケールアップ技術の確立における因子を特定するため、フラスコレベル、1 L ジャーファーメンター、30 Lジャーファーメンターでの酵素生産培養を行った。30Lジャーにおいて、培養圧力および、通気およびDO制御条件による撹拌力の違いといった物理的な因子が、酵素生産に影響している可能性が示唆された。
 2014年度内の発酵生産実証化設備の設置ヘ向け、主培養槽である3kL培養槽をはじ
めシード培養槽、pH制御用槽、流加槽等の付帯設備や、操作・制御方法について基本設計を行った。
英文要約Title: Construction of Innovative Saccharifying Enzyme-producing Microorganism and
Development of Manufacturing Technology of the Enzyme for the Biofuel
Commercialization (FY2013-FY2014) FY2013 Annual Report

This project is aimed at the development of a process technology package that can provide enzymes for bio-ethanol production on a commercial scale by 2020. It therefore has saccharification ability, 1 mg/g- generation of sugar or less, and requires enzyme cost of 40 yen / L-Ethanol. To achieve the project, we worked on three research subjects
1)Development of high performance saccharification enzymes
We're working on the establishment of an analysis method and culture conditions required for improved methods to search for high-performance enzymes. To acquire high-performance enzymes, we searched for candidate genes from various kinds of microorganisms and started cloning some genes. In addition, interaction analysis of component enzymes between biomass and substrate was initiated.
2) Engineering of industrial production strains optimized for the production of saccharificationenzymes
Cellulase-overproducing mutants of Trichoderma reesei have been considered
the prime source of enzymes needed for the economic saccharification of pretreated cellulosic biomass. We have obtained the high cellulase producer T. reesei PC-3-7, PCD-10 and CDU-11 strains. PC-3-7 was used as host for recombinant strains 1st generation strain, JN series, that expresses Aspergillus aculeatus BGL1 (AaBGL1). It had previously been reported that PCD-10 and CDU-11 strains showed higher cellulase production than PC-3-7. We therefore reevaluated features of T. reesei mutants to select a host for future work. Three strains were cultured in medium containing Avicel and xylan in a 1L Jar. In this case, we found that the cellulase production by PCD-10 increased 1.2-fold, compared to that from PC-3-7. On the other hand, cellulase
production by CDU-11 is the same amount as that produced by PC-3-7.
3)Development of low-cost large-scale production of saccharification enzymes using T. reesei
The use of low-cost substrates such as alkaline pretreatment of herbaceous
biomass was suggested as an alternative to reduce the production costs. The fermentation parameters (product and cells) of T. reesei were investigated by utilizing data on cell growth, pressure of CO2 in the exhaust gas, ammonia and phosphate in the fermentation broth. The commercial production of the technology developed in the laboratory for industrial application requires scaling up from the bench scale to the industrial scale. We designed a 3K liter scale fermentation pilot plant.
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