成果報告書詳細
管理番号20140000000792
タイトル平成23年度-平成24年度成果報告書 SBIR技術革新事業 「エンドトキシンの活性と存在量を単一分子計測する分光装置の開発」
公開日2014/12/6
報告書年度2011 - 2012
委託先名有限会社マイテック 学校法人関西学院
プロジェクト番号P08015
部署名イノベーション推進部
和文要約件名:平成23年度-平成24年度成果報告書 SBIR技術革新事業 「エンドトキシンの活性と存在量を単一分子計測する分光装置の開発」

弊社開発のSERSバイオチップは、表面増強ラマン散乱(SERS)スペクトル法の信号増幅作用に基づき、生体関連試料の単一分子感度検出用デバイスとして開発した量子結晶チップである。エンドトキシンの活性(強度指標)と存在量(物質量)の同時測定を行った。エンドトキシンはリムルス試薬(LAL)のゲル化によって分析されてきた。その高感度検出のためには、濁度測定や比色分析が行われてきた。近年、いくつかの研究グループはLALゲル化の初期段階を光散乱法により検出した事を報告している。その他の高感度手法として、蛍のルシフェラーゼを用いた生物発光が導入されている。これまでに報告されたエンドトキシン分析手法の感度・測定時間と比較する事でSERS検出の利点を確認した。すなわち、感度のみならず測定時間についても圧倒している。さらに、従来法の1/1000という少量のLAL試薬でもエンドトキシンを検出することができた。溶液を直径7mmの金属基板に滴下した。3分後、溶液を除去し、銀微結晶が生成している事を確認した。標準エンドトキシン水溶液(500EU/L)をそのSERS基板に滴下し、785nmの波長のレーザー励起でSERSスペクトルを測定した。滴下直後にエンドトキシンによるSERSピークが出現した。LAL試薬を1/1000に希釈しても同じ位置にピークが出現したので、LAL試薬を劇的に削減する事に成功し、このチップで100EU/Lの濃度のエンドトキシンを検出できた。エンドトキシン定量分析のためにエンドトキシン結合性タンパク質・ペプチドを採用した。その中でもリポ多糖結合タンパク質ではエンドトキシンによる新たなピークが観測された。我々は、人工透析などでのエンドトキシン分析に必要なバイオセンサーの市場価値を調査した。日本での患者数は29万人であり、年3%で増加している。彼らは4171の病院で年300万回透析を行っている。このように、我々の技術は簡便なエンドトキシン検出に必要とされるであろう事を確認した。このSERS技術の重要な点は汚染がおこらない事である。SERSチップはLAL試薬が擬陽性を示す物質を排除するためにキャピラリー中に封入される。コスト削減により、SERS基板の価格を2013〜2014年には一枚500円、2015年には40%削減可能である。このチップの基礎となる特許出願を行った。
英文要約Title:Technology Innovation Program for Small Business Innovation Research / Development of spectrometer for detection of endotoxin at a single molecule level(FY2011-FY2012) Final Report

The SERS biochip of our development is a quantum crystal chip developed based on the signal amplification action of a surface-enhanced-Raman-scattering (SERS) spectral method as a device for single molecule sensitivity detection of a living body related sample.We performed coincidence measurement of the activity and the amount of existence of endotoxin.
Endotoxin has been assayed by gelation of Limulus amebocyte lysate (LAL). For the sensitive detection, turbidity measurement and colorimetric analysis have been applied. Recently, some research groups reported that the early stage of LAL gelation is detectable by the laser scattering photometry. Another sensitive method has been introduced, that is a bioluminescence using firefly luciferase.
By comparing the sensitivity, and measuring time of the reported endotoxin assay methods, we confirmed advantage of the SERS technology. By that, we can overcome not only the the sensitivity but also the due time. In addition, endotoxin could be detected by a small quantity of LAL, less than 1/1000 scale of the conventional methods.
The solution was dropped on a metal substrate with a diameter of 7 mm. After 3 minutes, the solution was removed and confirmed the silver nanocrystals were assembled on the metal plate. Aqueous solution of the standard endotoxin (500EU/L) was dropped on the SERS substrate. SERS spectra were measured by laser light excitation at 785 nm. At immediately after the dropping, SERS peak due to endotoxin appears. Using a dilute LAL solution (1/1000 of the original solution), the peak was appeared at the same position. The reagent amount is dramatically low level of LAL for endotoxin assay, have been reported to date. By this SERS chip, we could evaluate 100EU/L endotoxin.
For the quantitative analysis of the endotoxin, some endotoxin binding proteins, peptides were applied. Among them, lipopolysaccharide binding protein (LBP) indicated a new SERS peak due to endotoxin.We look into the commercial value of the endotoxin biosensors, the market which need endotoxin assay, the most convincing should be a blood dialysis. In Japan, the number of the patients is 290 thousands and shows an increase of 3 percent over every year. They are running dialysis 3 million times for a year in 4171 hospitals, etc. Thus, we confirmed our technology will meet the need of clients for the facile endotoxin detection.Key point of the SERS technology is free from the contamination. The SERS chip could be installed into the glass capillary to eliminate the fungal or others that have positive effect on LAL. By strategic cost cutting, we are estimating a price of the SERS substrate at 500 yen per one sheet in 2013–2014 and that the price will drop about 40 % in 2015. We performed some patent applications on the basis of SERS substrate.
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