成果報告書詳細
管理番号20140000000793
タイトル平成23年度-平成24年度成果報告書 SBIR技術革新事業 「ガレクチン-8糖認識ドメインによるエンドトキシン測定法の開発」
公開日2014/12/6
報告書年度2011 - 2012
委託先名医化学創薬合同会社
プロジェクト番号P08015
部署名イノベーション推進部
和文要約件名:平成23年度-平成24年度成果報告書 SBIR技術革新事業 「ガレクチン-8糖認識ドメインによるエンドトキシン測定法の開発」 

エンドトキシンを短時間に高感度(最終的には10EU/L)で測定でき、かつ安価な装置を開発することを目的とし、カブトガニの血球抽出成分より調製されたライセート試薬を用いる従来法とは全く異なるエンドトキシンの高感度測定方法を検討した。すなわち、エンドトキシンがガレクチン-8の糖認識ドメイン(以下CRD)と結合することが知られているので、ガレクチン-8のCRD(以下Gal-8)を用いた高感度なエンドトキシン捕捉による測定方法を開発することにした(F/Sでは100EU/L)。我々はSH基を有するナノ粒子とフォスフォリルコリン誘導体が反応するとナノ粒子の表面に自己組織化単分子膜ができること(以下PC/SAMs)、そしてピロリ菌由来のフコース転移酵素にある膜結合ペプチド(以下MAP)がPC/SAMsと強く結合し、酵素の活性サイトを外側に提示するという知見を得ていた。そこで、MAPを介してGal-8と蛍光を有する量子ドット(以下QDs)とを結合させれば高感度測定系が開発できると考えた。技術動向調査と市場調査を行い、感度の向上にニーズのあることが分かった。また、新しい技術開発が行われていたが、いずれも最終的にはライゼートを用いるものであり、我々のようなコンセプトを検討しているものはなかった。我々のコンセプトを検証するため実験を行った結果、次の成果が得られた。1.Gal-8の遺伝子配列の中間にMAPの23アミノ酸残基分の遺伝子を挿入したコンストラクトを構築し、遺伝子をクローニング、増幅させ、別に調製した2種の発現用ベクターに連結し、4種の発現用大腸菌に導入した。2.融合タンパク質の発現誘導条件として、温度、時間、グルコースの添加の有無等を検討した結果、発現ベクターとしてpET-22b、発現用宿主としてBL21(DE3)を用い、1%(w/v) glucose存在下、0.1 mM IPTG、30℃で4 hrsの条件が良いことが分かった。融合タンパク質の発現は、抗Gal-8抗体によるウェスタンブロットでのバンドの出現で確認した。3.疑似生体膜成分であるPhosphorylcholine誘導体(以下PC)を合成し、QDs及び磁気ビーズにコーティングし、リン脂質自己組織化膜 Phosphorylcholine Self Assembled Monolayers (以下PC/SAMs) を作製した。4.Gal-8 /MAPをQDsと反応させた場合、未反応のGal-8 /MAPを分けることが困難であったため、エンドトキシン(以下ET)を捕捉可能で限外濾過で除去可能なポリミキシンBをQDsに提示した。5.ポリミキシンBの提示量を変えたQDsを用いてETを測定した結果、ポリミキシンBを提示していないPC/SAMs/QDsだけでも700 EU/Lの濃度で定量可能であることが分かった。このことはETの脂質部分がPC/SAMsと強く結合していることを示していると考えられる。
英文要約Title: Technology Innovation Program for Small Business Innovation Research / The development of new method for measurement using the ability of galectin-8 carbohydrate recognition domain to capture endotoxin (FY2011-FY2012) Final Report

Target: The final goal of R&D is to make a machine which is a compact size and is able to measure endotoxin of 10EU/L. But in the stage of F/S, our goal is to gain a proof of concept that galectin-8 carbohydrate recognition domain (shortly Gal-8) is able to capture endotoxin and to measure it at the level of 100EU/L.Concept: We have revealed that the reaction of phosphorylcholine derivertive and nano-bead with SH-function makes the formation of self assembled monolayers on the bead (PC/SAMs) possible. And it was also revealed that membrane anchoring peptide (MAP) in fucosyltransferase binds tightly to PC/SAMs and arranges an active site of enzyme outer side.As it is known that Gal-8 reacts to endotoxins of wide range of bacteria, so it would be possible to detect endotoxin to use Gal-8/MAP fusion protein bound on PC/SAMs bead.Progress: According to the market research and the trend survey of technology, we found that the improvement of sensitivity of endotoxin measurement is needed and every new technology is used of a limlus amebocyte lysate. We pursued the experiments to obtain the proof of concept (POC) and achieved the following results.1) We succeeded to produce a fusion protein of Gal-8 and MAP by E. coli. 2) The expression of Gal-8 was confirmed by western blot and the function of Gal-8 is confirmed by the absorption of Gal-8 to lactose.3) We succeeded to synthesize phosphorylcholine derivertive and to produce nano-particles coated with PC/SAMs both on a magnetic bead and quantum dots (shortly QDs) which emit fluorescence.4) As it was difficult to separate the nonbonding Gal-8/MAP to QDs, we used polymixin B instead of Gal-8/MAP to capture endotoxin. Nonbonding polymixin B was separated by using of ultra filtration to the complex of polymixin B and QDs.5) We revealed that only PC/SAMs/QDs (without polymixin B) was able to bind endotoxin and lowered fluorescence intensity. At present 0.1 ng/ml (700EU/L) could be measurable.
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