成果報告書詳細
管理番号20140000000397
タイトル平成22年度-25年度成果報告書 ヒト幹細胞産業応用促進基盤技術開発 ヒト幹細胞実用化に向けた評価基盤技術の開発 (国立大学法人京都大学)
公開日2015/3/10
報告書年度2010 - 2013
委託先名国立大学法人京都大学
プロジェクト番号P10027
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約1.研究開発の成果と達成状況
1 研究開発の成果
要約
1 ヒトES細胞の安定な培養・保存技術の開発
1.1. 安定、安全にヒトES細胞を維持するペプチド・タンパク質などの成長因子をはじめ、化学合成困難な高分子成分を代替できる低分子化合物による合成培地の開発(京都大学、日産化学工業、リプロセル)

ヒト多能性幹細胞の未分化維持に効果のある低分子化合物のスクリーニングが可能なHigh-Content Screening (HCS)システムを開発した。これを利用して、効果のあるヒット化合物を見出すことに成功した(京都大学、再生研)。
3種類の化合物を用いることで、これまで必要とされてきたbFGFとTGFβタンパク質を用いず、世界で最もタンパク質成分の少ないヒトES用の培地を開発に成功した(京都大学、iCeMS)。
低分子化合物のスクリーニングを実施し、ここで得られた活性化合物の候補について再現性の確認、他の指標による効果確認などの検討を行った。その結果、ヒトES細胞を未分化状態に維持する効果が期待されるシード化合物4点を取得した(日産化学工業)。
ゼノフリー培地を開発し、その培地を用いてヒト多能性幹細胞の長期培養試験を行い、様々な株で安定的な未分化維持培養が可能であることを示した。2013年7月16日にNEDOの成果産物として、国産ゼノフリー培地ReproXFを上市した(リプロセル)。

1.2. 化学合成/高分子技術を用いたヒトES細胞の三次元大量培養を可能にするための培養基質および培養基材の開発(京都大学、日産化学工業、リプロセル)

ナノファイバー技術を応用し、フィーダー細胞やマトリゲルなどに代わる新規細胞培養基材の開発に成功し、それを応用することによってヒトES細胞3次元培養技術の開発に成功した。また、日産化学との共同研究により、生体材料を用いない新規ポリマーの開発にも取り組みナノファイバー化に成功した(京都大学、iCeMS)。
ヒトES細胞の増殖において最適な足場を構築するため、各種の合成ポリマーをコーティングした基板を調製した所、細胞接着に効果が期待されるポリマーを見出した。さらに、本ポリマーのファイバー化を種々検討し、ヒトES細胞の接着と増殖を促進する効果を見出した(日産化学工業)。

1.3. 閉鎖系細胞培養容器と三次元培養方法を組み合わせたヒトES細胞の培養法の開発(京都大学、ニプロ、リプロセル)

高品質のヒトES細胞を安定的に大量供給するために、1非酵素処理による継代法の確立、2メチルセルロースの添加による融合スフェアの割合の減少に成功、3ジェランガムの添加による撹拌の不必要な三次元スフェア培養を開発した(京都大学、iCeMS)。
細胞接着性の閉鎖系培養バッグを用いて接着系の自動培養装置を開発した。さらに京都大学で開発したヒトES細胞三次元培養法に適した自動培養装置を検討するために、培地交換及び継代作業工程の小型試作機を作製し、三次元培養法の培養プロトコールを検討した。この培養プロトコールを元に自動培養装置のプロトタイプを作製した(ニプロ)。

1.4.ヒトES細胞の状態を培養下で生きたまま検定するための、多パラメータ観察技術などのイメージング技術による生細胞検査技術の開発(京都大学、浜松ホトニクス、リプロセル)
培養中のヒトES細胞コロニーの状態を非侵襲で測定するイメージング装置を開発し、4つの細胞株について分析を行った。その結果、細胞状態を評価する候補パラメータを見出した(浜松ホトニクス)。

1.5.自動化が可能なヒトES細胞の高効率凍結保存技術の開発(京都大学、ニプロ、リプロセル)
毒性を有するDMSOを用いない新しい凍結培地の開発に成功した。この凍結培地を用い、ヒト多能性幹細胞での効率の良い緩慢凍結保存に成功した(京都大学、再生研)。
閉鎖系凍結保存技術の開発として、凍結に使用する閉鎖系容器開発に着手した。液体窒素が容器内に混入せず、容易に内部の細胞懸濁液が回収可能な試作品を作製し、耐凍結融解性の予備評価を行い、ガラス化法、緩慢凍結法において問題のないことを確認した(ニプロ)。 ヒトES細胞の品質評価指標の開発
2.1 ヒトES細胞の分子生物学的情報の取得および解析技術・検定キットの開発(京都大学(再委託先:理化学研究所)、島津製作所、ジェネテイン、住友ベークライト、タカラバイオ、リプロセル)

ヒト幹細胞及び由来製品の安全性評価について遺伝子発現、ゲノム変異、エピゲノム変化等の分子生物学的な品質示標を中心とした統合解析パイプラインの構築を行うと共にプロジェクト参画企業と協力して検査試薬キットなどの製品化を行った(京都大学、再生研)。
エピゲノム情報がヒトES細胞の品質や分化指向性の評価として使えるか、検討するために、複数のヒストンメチル化状態の網羅的解析を行った。そこから、品質評価に使えそうな遺伝子の抽出を進めた(理化学研究所)。
英文要約Title: Beyond the Fusion of Academia and Industry in Japan: an Integrated System for High Quality and Large Scale Production of hPSCs and Derivative Cells
Summary
1 Development of stable culture and preservation technologies of human ES cells

1.1Development of the synthetic medium by the low molecular compound which replace growth factors, such as peptide protein which maintains human ES cells stably and safely, and can substitute for a macromolecular component with difficult chemical synthesis(Kyoto University, Nissan Chemical Industries, RiproCELL)

We developed a HCS (High-content Screening) platform to identify small chemicals that promote hESC self-renewal. Using the screening system, we identified novel small molecules that promote long-term hESC self-renewal without bFGF in the medium (Kyoto University, IFMS).
We have developed a defined hESC culture medium without bFGF and TGFβ by utilizing 3 chemical compounds. To date, this medium is most simple and least including proteins in the world (Kyoto University, iCeMS).
We have screened various chemical libraries and obtained some active compounds which had a potential to maintain hPSCs in undifferentiated state (Nissan Chemical Industries).
We developed a Xeno-free culture medium, “ReproXF” and evaluated it. ReproXF showed that stable undifferentiated maintenance cultivation was possible for several cell lines. The Xeno-free culture medium ReproXF was marketed as a result product of NEDO project on July 16, 2013 (RiproCELL).

1.2. Development of culture-medium and materials which enable to large-scale 3D production of human ES cells by using chemical synthesis/polymer technology (Kyoto University, Nissan Chemical Industries, and RiproCELL)

We have developed the new cellular substrate by applying nanofiber technology. This substrate allowed establishing the 3D culture system for human ES cells. Furthermore, in collaboration with Nissan Chemical Industries, we have developed new polymers to establish nanofibrous cellular scaffolds without biomaterials (Kyoto University, iCeMS).
We have screened some synthetic polymers for the ability of ES cell-scaffolds, and obtained a new polymer which can promote the attachment of ES cells to the surface of culture vessel (Nissan Chemical Industries).

1.3. Development of the culture procedure of the human ES cells which combined the closing cell culture system and the three-dimensional culture method (Kyoto University, Nipro, and RiproCELL)

Utilizing human pluripotent stem cells (hPSCs) requires large-scale cell production. Here, we established a simple 3D sphere culture system that incorporates mechanical passage and functional polymers, methylcellulose and Low-Acyl Gellan Gum (Kyoto University, iCeMS).
We developed the automated cell culture system using closed culture-bag system for adherent ES/iPS cells. Furthermore using suspension culture method developed by Kyoto Univ. to automated culture instrument, we developed a prototype instrument of automated cell culture system for suspension culture (Nipro).

1.4. Development of the live cell inspection technique by imaging technology for authorizing living under cultivation of the state of human ES cells, such as multi-parameter observation technology (Kyoto University, Hamamatsu Photonics, and RiproCELL)

We have been developing an imaging system to evaluate the quality of the hES cells in culture with non-invasive manner. We have tested 4 cell lines and we found the characteristic pattern of optical parameters to evaluate the quality of hES cells (Hamamatsu Photonics).
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