成果報告書詳細
管理番号20140000000553
タイトル平成22年度-平成25年度成果報告書 「ヒト幹細胞産業応用促進基盤技術開発 ヒト幹細胞実用化に向けた評価基盤技術の開発 ヒト幹細胞の安定的な培養・保存技術の研究開発」(株式会社ツーセル、国立大学法人大阪大学、学校法人福田学園、国立大学法人広島大学、株式会社スペース・バイオ・ラボラトリーズ、DSファーマバイオメディカル株式会社、株式会社丸菱バイオエンジ)
公開日2015/3/10
報告書年度2010 - 2013
委託先名株式会社ツーセル 国立大学法人大阪大学 大阪保健医療大学 国立大学法人広島大学 株式会社スペース・バイオ・ラボラトリーズ DSファーマバイオメディカル株式会社 株式会社丸菱バイオエンジ
プロジェクト番号P10027
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約件名:平成22年度-平成25年度成果報告書 ヒト幹細胞産業応用促進基盤技術開発 ヒト幹細胞実用化に向けた評価基盤技術の開発 ヒト幹細胞の安定的な培養・保存技術の研究開発」

1.滑膜由来MSC大量培養基盤技術の開発滑膜由来MSCの無血清培地の検討
 大阪大学より3年間で41株のヒト滑膜組織を譲り受け、研究用の無血清培地STK1、STK2でヒト滑膜由来MSCの樹立と増殖を行うことが可能であることを確認した。また、培地を臨床で使用するには、原材料中のタンパク質成分をアニマルフリー化するだけでは足らず、「生物由来原料基準」の規定を満す原材料のみを使用する事が重要であることが分かり、臨床用培地の設計を試みた。
 大量培養した滑膜由来MSCが癌化する危険性を評価するために、軟寒天コロニー形成法、染色体異常試験、重度免疫不全マウスを用いた造腫瘍試験を行った結果、腫瘍形成はみられなかった。
 大量培養した細胞の有効性確認のために、増殖培養したブタ滑膜由来MSCより作製した移植体を軟骨損傷モデルブタに他家移植し、6ヶ月間の経過観察を行った。一部の移植体では、肉眼で軟骨様の白色組織で損傷部が被覆されており、組織学的にも損傷部に軟骨形成の指標となるサフラニンOで染色される組織を認めた。また、修復した組織の力学性試験を行い、表層の剛性に関しては、通常軟骨と比較して細胞製品を移植した検体では低いことが示唆された。安全性に関しても、移植後局所での炎症所見等がみられないことを確認した。
2.滑膜由来MSCの大量培養方法の開発
 大量培養システムの試作機を完成させた。50mL遠沈管様培養チューブ1本の中に細胞を接着させるための特別な処理を施したフィルムを挿入した容器(特許出願済、意匠取得済)を微小重力環境細胞培養装置(特許出願済、意匠取得済、製品名:Gravite)に搭載することにより、培養空間を最大限活用することを可能にした。無血清培地を使用して大量培養することで、他家移植への道を拓くシステムである。
3.培養細胞評価基盤技術の検討
 移植体がMSCであることを確証するための分子マーカーとして、線維芽細胞と発現レベルが異なる4つの遺伝子に絞りこみ、(A)滑膜由来MSCの無血清培養の継代数を多くした時のマーカー遺伝子の発現の変化と、(B)移植体がMSCであることの2点を確証するために、滑膜MSC特定マーカー候補が有用か否かを検討した。
 以上より、移植体及び大量培養した細胞において、陽性候補マーカーの2種と陰性マーカー候補2種はMSC特定マーカーとして有用であることが判った。
4.細胞保存液の検討及び細胞保存条件の検討
 DMSO不含の製品では安定的に無血清で増殖させた細胞を凍結させることが難しい事が明らかとなった。このような中で、PMDA薬事戦略相談に保存液の相談を行った中で、DMSO入りの製品でも臨床使用に問題ないことが判明したことから、原料選択基準が高く生物由来原料基準に適合する保存液としてセルバンカー3が適当であることが判った。また、プログラムフリーザーを用いて細胞凍結と融解の両方を行うことにより、CAS制御による解凍で融解直後のサンプルから効率よく細胞数を増殖することが出来ることが明らかとなり、凍結だけでなく融解時も重要であることがわかった。
英文要約Title: Development of Core Technologies for Industrial Applications of
Human Stem Cells「Development of Technologies for Large-scale Human Stem Cell Production and Preservation」 (FY2010-FY2013) Final Report

1. Development of Serum-free Culture Technologies for Large-scale Synovium-derived Mesenchymal Stem Cells (SY-MSC)

Production
Using synovial tissue samples from 41 donors, we verified the ability of
serum-free medium (STK1, STK2) to establishing and expanding of SY-MSC. We
also tried to make clinical available serum-free medium based on Japanese
Standards for Biological Ingredients.
For estimation to tumorigenicity derived from large-scale cultured SY-MSC, we carried out the soft agar colony formation assay, chromosome
aberration tests, and tumor formation test (NOG mice). Results of all
these tests

revealed that no tumor formation was observed.
To confirm the effectiveness of large-scale cultured SY-MSC, we transplanted the cellular products prepared from expanded porcine SY-MSC to allogeneic porcine of chondraldefect model. Follow-up to 6 months, it was visible
that chondrogenic-like tissue covered the lesion zone in some of
recipients. We also ascertained histologically that the repaired tissue
existed in lesion zone was stained by Safranin O which is an indicator of
cartilage formation. While concerning the safety of allogeneic
implantation test, we also confirmed that inflammation in local
transplanted area cannot be found.

2. Development of Culture Method for Large-scale SY-MSC Production
We have completed the prototype for larger scale culture system. The
system realized to enlarge the culture capacity of allogeneic MSC by
insertion of special processing film (patent applied, design acquired)
into 50ml tube and is possible to take full advantage for culture area by
mounting the above culture container on the microgravity dispenser device
which was named Gravite (patent applied, design acquired).

3. Development of Basic Technology for SY-MSC Assessment
To identify the gene marker specific to SY-MSC, we narrowed 4 gene
markers which expressed at much higher levels in SY-MSC than in
fibroblasts. We found that the expression features of these 4 gene markers was existed even more than in 7th passages of serum-free cultured SY-MSC.
These 4 markers were revealed useful in confirmation of SY-MSC quality.

4. Development of Cryopreservation Technologies for SY-MSC
We revealed that the freezing of SY-MSCs with non-DMSO cellular
cryopreservation media is difficult. In carrying out the consultation on
stock solution with PMDA, it became clear that using the product contained DMSO is also no problem. So we determined to adopt CELLBANKER-3 which has a high criterion in raw materials selection and is also compatible with
the Japanese Standard for Biological Ingredients. We revealed that CAS
control system of thawing frozen cells with program freezer is more
effective for cell proliferation, and not only cell freezing but also cell
thawing step is also equally important.
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