成果報告書詳細
管理番号20150000000120
タイトル平成22年度-平成26年度成果報告書 次世代機能代替技術の研究開発 次世代再生医療技術の研究開発 少量の細胞により生体内で自己組織の再生を促す自律成熟型再生デバイスの開発(生体内で自律的に成熟する臓器再生デバイスのための基盤研究開発)
公開日2015/6/25
報告書年度2010 - 2014
委託先名国立大学法人東京大学 国立大学法人大阪大学 学校法人東京理科大学 野村ユニソン株式会社 国立大学法人神戸大学 学校法人福田学園大阪保健医療大学
プロジェクト番号P10004
部署名ロボット・機械システム部
和文要約件名:平成22年度-平成26年度成果報告書「次世代機能代替技術の研究開発 次世代再生医療技術の研究開発 少量の細胞により生体内で自己組織の再生を促す自律成熟型再生デバイスの開発(生体内で自律的に成熟する臓器再生デバイスのための基盤研究開発)」

軟骨組織再生技術の汎用化、産業化を進めるため、臓器構造体としての軟骨の自律成熟に着目し、関節やその他の欠損部位を修復させるための基盤技術を確立するため、以下の項目の研究開発を行った。軟骨用自律再生デバイスのための細胞培養法の開発として成長因子を担持した新規ハイドロゲルを用いた徐放化システムを確定した。この徐放化システムを用いて、自律再生デバイスが内蔵されたモジュールにブタ滑膜由来細胞を注入し、培養を行った。培養約2週間後、滑膜由来細胞ともに約10倍の細胞増殖が認められ、中空糸を用いたモジュール循環培養システムの方法を確立した。骨用自律再生デバイスのための細胞配置法開発として微小人工骨としてα-TCP製テトラポッド形状人工骨 (Tetrabone)の仕様決定を行った。軟骨用自律再生デバイスの探索的動物実験として (再委託:富士ソフト)ブタの軟骨骨欠損モデルを開発し、滑膜由来細胞を欠損部に移植した。β-TCPは骨部、徐放化ハイドロゲルは軟骨部、中空糸は骨軟骨を連結し、関節面の荷重負荷に対する耐性および栄養循環、老廃物の迅速な排出を促す。このようなパーツを具備する自律再生デバイスを作製し、ブタの移植実験を行い、軟骨再生を確認した。ポリ乳酸中空糸の特性を評価し、細胞培養に適したモジュールの製造技術を確立した。埋め込み時の初期には一定の強度を有し、6ヶ月以降では分解が進み体内に直接埋め込む事ができる製品設計ができた。また、PLLAを用いてメッシュトレイを作製し、自律再生デバイス固定材を確定した。これらの結果をもとに、臨床導入に資する非臨床データを取り揃えた。関節用自律再生デバイスのための細胞培養法の開発としては、多分化能を維持しつつ、かつ幹細胞の増殖速度を従来の牛血清に比して10倍以上に増す性能をもち、かつ添加物内容が全て同定され安全性の担保される無血清培地の開発に成功した。また、TEC作製過程における培養皿の表面をナノレベルに配行させることにより、TEC内のマトリックス構造を変化させることで、特定方向に対して硬度と強度を向上させたTECの開発に成功した。低侵襲な関節鏡視下での骨軟骨再生を目指し、乏血小板血漿(PPP)と小形状β-TCPもしくはHydroxyapatiteや東京大学が開発したα-TCP(テトラボーン)との配合・ゲル化による可塑性を有した粘土様人工骨を開発した。混合するだけで細胞に対して非侵襲的にゲル化が生じるin situゲル化システムの確立を目的として、時間オーダーにして混合後十分以内に成型可能なゲル化材料の開発に成功した。剤型として、化学架橋ゲル化システムについて条件最適化を行い、ペプチドファイバーの三次元構造を保ったまま力学強度を付与するゲルの作成に成功した。このゲルを用いてヒト由来軟骨細胞の培養を行った結果、生存率と軟骨分化能、いずれの点においてもコラーゲンゲルを越える組織再生力を示した。特にグリコスアミノグリカン等の軟骨基質の産生が顕著であった。さらに架橋剤の構造を検討した結果、架橋構造に基づくゲルの力学特性を制御可能であり、同時に細胞増殖、生存率、分化状態に直接的に影響することが明らかとなった。この構造はIGF-Iなど成長因子の機能性を保ったまま長期にリリースを行うタンパク質担持型足場ゲル材料であることが分かった。その結果、成長因子であるFGF-2およびIGF-1を担持させたハイドロゲルを用いることにより、in vivo移植実験において、従来のアテロコラーゲンを用いた移植法にくらべ約20倍の基質蓄積量の増加が認められた。
英文要約Title: Fundamental Research Project for Autonomous Regeneration Device (FY2010-FY2014) FY2014 Final Report

Reconstruction of joints, based on autonomous regeneration of cartilages, would enable to promote generalization and industrialization of cartilage tissue engineering. In this project, we will establish an industrialization technology to apply the autonomous regeneration for reconstruction of joints. To develop of the cell culture method for autonomous regeneration devices for cartilage, the optimal condition of controlled release system using the hydrogel with growth factors and micro-particles was examined as for density and combination of the components. Applying this system, porcine MSCs or MSCs derived from synovium were injected into the module with an autonomous regeneration device in it and cultured in the device by recirculating culture media through hollow fibers. Both kinds of cells increased ten-fold in 2 weeks; therefore, we concluded the controlled release system was established. To develop the orientation of the cell for autonomous regeneration devices for bone, to prevent the slack between an osteochondral device and a host bone, we have examined PLLA, which is a constituent of hollow fibers, in terms of the mesh size, mechanical strength, tolerance and safety for a load, and narrowed the optical conditions of these items. Regarding the hollow fiber membrane, Poly(lactic acid) was used as a biodegradable polymer and poly(lactic acid) hollow fiber membranes were prepared by nonsolvent induced phase separation. The pure water permeabilities of the obtained membranes were from 39 L/m2 h atm to 950 L/m2 h atm (OD:1.3 mm-1.6 mm).As the development of a hollow fiber module becoming the reproduction organization lifeline, we-evaluated-the-characteristic-of-the-polylactic-acid-hollow-threadand-established-the-module-suitablefor-cell-growth.-It-was-possible-for-the-product-design-that-thehollow fiber-could-resolve-in-biological process for six-months and there was constant dynamic strength in the early time of the transplantation.-Regarding the hydrogel, we describe the one-pot fabrication of injectable hybrid hydrogel, injectable hydrogels have emerged as promising biomaterials because of their biocompatibility, excellent permeability, minimal invasion, and easy integration into surgical procedures. These systems provide an effective and convenient way to administer a wide variety of bioactive agents such as proteins, genes, and even living cells. Additionally, they can be designed to be degradable and eventually cleared from the body after completing their missions. Given their unique characteristics, injectable biodegradable hydrogels have been actively explored as drug reservoir systems for sustained release of bioactive agents and temporary extracellular matrices for tissue engineering. This report provides an overview of our results performed in this NEDO project towards constructing a rational design of injectable, bioactive, and biodegradable hydrogels for protein drug delivery and tissue engineering. In this project, we studied the one-pot fabrication of injectable hybrid hydrogel, which consist of Chitosan-poly(ethylene glycol) (PEG) and RAD16 self-assembling peptide. A primary network was quickly formed based on a self-assembling of RAD16, and then a chemical cross-linking of Chitosan/PEG was proceeded as the independent secondary network. The chemical reaction between primary amines of chitosan and active esters terminated at PEG chains was safely cross-linked without toxic by-products. The interpenetrating polymer network (IPN) like structure was induced by the difference of the cross-linking mechanism and the gelation time between two networks of chitosan-PEG and RAD16 self-assembling peptide.
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