成果報告書詳細
管理番号20150000000124
タイトル平成25年度-平成26年度成果報告書 がん超早期診断・治療機器の総合研究開発 超早期高精度診断システムの研究開発:血液中のがん分子・遺伝子診断を実現するための技術・システムの研究開発 血中分子・遺伝子診断のための基礎技術の研究開発(がんの発症を予測するシステムの開発 乳がん感受性評価システムの研究開発)
公開日2015/6/25
報告書年度2013 - 2014
委託先名東洋紡株式会社 国立大学法人山口大学
プロジェクト番号P10003
部署名ロボット・機械システム部
和文要約件名:平成25年度-平成26年度成果報告書 乳がん感受性評価システムの研究開発

乳がん感受性と特異的に相関するDNAコピー数多型 (CNV:DNA copy number variation)を利用した乳がん発症感受性評価システムを開発・実用化し、国民の健康に寄与することを目的とする。この目的を達成するために、血液由来DNA試料収集と乳がん感受性データベース構築および乳がん感受性CNV評価システムの開発を行った。文書による同意が得られた乳がん患者から血液を採取した。また、健常者についても被験者を募集し、文書による同意を得た後に、血液を採取した。得られた検体よりDNAを抽出した。健常者に対してはアンケート調査を行い、乳がん検診受診状況や乳がん発症の有無、ライフスタイル(食事、運動)状況などについての調査を行った。デジタルPCRおよびリアルタイムPCR解析のためのターゲット領域およびリファレンス遺伝子(RNase)のTaqManプローブおよびプライマーを設計した。乳がん患者群および健常者群について、デジタルPCRおよびリアルタイムPCRを行い、CNVデータを得た。複数のCNV領域のコピー数について乳がん群とコントロール群で比較したこところ、1つのCNVが、コントロール群に比べて乳がん群でコピー数が低いことが分かった。さらに、ROC(Receiver Operating Characteristic)曲線の結果からAUC(area under the curve)は0.81であり、本CNVは乳がん群とコントロール群の識別能が高いことが明らかとなった。CNV測定には、TaqMan-probe法を用いたリアルタイムPCRがよく用いられるが、TaqMan-probeは非常に高価である。そこで、検査費用の低コスト化を実現すべくQ-probe法によるCNV測定試薬の開発に着手した。初めに、山口大学が同定した乳がん感受性CNV候補群を、TaqMan-probe法を用いて定量するトレース実験を行い、CNVの測定が可能であることを確認した。次いで、CNVの定量法として、相対定量法であるリアルタイムPCRに加え、絶対定量法であるデジタルPCRを立ち上げ、標準物質なしでのCNV値の定量を可能とした。前記結果を基にQ-probeを設計することで、TaqMan-probe法との相関係数:r=0.93、再現性:CV=10%と、TaqMan-probe法と同等性能でかつ安価なCNV測定試薬を開発した。本システムの普及には、安価な検査試薬の供給に加えて、工程の自動化により日常検査として使用できる簡便なシステムの開発が必要である。東洋紡が保有するGENECUBE(R)は、全自動遺伝子解析装置である。しかし、GENECUBE(R)は定性評価のみが可能であり、CNV測定に必要な定量評価には対応していない。そこで、GENECUBE(R)の自動性と高速性の優位性を活かしつつ、定量が可能な次世代GENECUBE、および解析ソフトの開発に着手した。次世代GENECUBEは、GENECUBE(R)の熱サイクル機構を変更することにより作製した。前記次世代GENECUBEと解析ソフトを用いて、CNVの1copy、2copyの差を判別可能であることを確認した。本プロジェクトにより、乳がん感受性CNVデータベースおよび乳がん感受性CNV評価システムを構築することができた。
英文要約Title: Research and development of a new system of risk assessment for breast cancer susceptibility (FY2013-2014): Final report

To develop a new system of risk assessment for breast cancer susceptibility, we performed this project using DNA copy number variations (CNV) associated with breast cancer risk.We collected DNA samples derived from blood and established a CNV database and a new system of risk assessment for breast cancer susceptibility.The study protocol was approved by the institutional review board of Yamaguchi University Graduate School of Medicine, and informed consent was obtained from each patient.DNA was extracted from peripheral blood of women without a history of breast cancer (control group) and from patients with a history of breast cancer (breast cancer group).A questionnaire survey was performed for the control group to investigate previous history of medical checkups for breast cancer and lifestyle including daily food intake and sports.Digital and real-time PCR were performed to establish a CNV database of breast cancer susceptibility using DNA samples from the control group and breast cancer group.We designed forward and reverse primers and TaqMan MGB probes of target regions and RNaseP. RNaseP was used as the internal control because it is known to exist in two copies in a diploid genome.We found that one of the CNVs was significantly associated with breast cancer susceptibility.According to receiver operating characteristic curve analysis, the area under the curve was 0.81, demonstrating good discriminatory power.For CNV measurement, the real-time PCR method with a TaqMan-probe is commonly used, but this probe is very costly.To reduce this cost, we have started to develop a CNV measurement reagent with Q-probe. First, to trace the experimental results, the CNV value of DNA samples from Yamaguchi University was measured by real-time PCR method with TaqMan-probe, and it was confirmed that CNV can be measured at TOYOBO. Secondly, as an absolute quantitative method, a digital PCR system was also set up at TOYOBO, which enables CNV measurement without using reference samples.Then, based on the above results, a Q-probe for CNV measurement was designed, and we developed a low-cost reagent with high performance equivalent to the TaqMan-probe.To generalize this method as a routine laboratory test, an easy-to-use automated system is also required as is a low-cost reagent.TOYOBO’s GENECUBE(R) is a fully automatic genetic analyzer.However, because GENECUBE(R) is a qualitative PCR device, we have remodeled GENECUBE(R) and also developed new analysis software to enable quantitative analysis.The next-generation GENECUBE was developed by changing the heat cycle mechanism of the GENECUBE(R).Finally, it was confirmed that it was possible to distinguish the difference between 1 copy and 2 copies by using the next-generation GENECUBE(R) and the new analysis software.A CNV database and CNV measurement system to evaluate breast cancer susceptibility was successfully built in this project.
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