成果報告書詳細
管理番号20150000000574
タイトル平成22年度-26年度成果報告書 「がん超早期診断・治療機器の総合研究開発 超早期高精度診断システムの研究開発:血液中のがん分子・遺伝子診断を実現するための技術・システムの研究開発 血中分子・遺伝子診断自動化システムの研究開発(血中がん遺伝子診断の検体処理自動化システム)」(コニカミノルタ株式会社)
公開日2015/7/17
報告書年度2010 - 2014
委託先名コニカミノルタ株式会社
プロジェクト番号P10003
部署名バイオテクノロジー医療技術部
和文要約末梢血中のがん細胞(CTC)は、末梢血中に極微量しか存在せず、かつ、末梢血には多量の白血球が含まれていることから、高い検出感度が必要とされる。CTCを検出する方法として、多くの既存技術では免疫学的手法を用いた方法が採用・開発されているが、免疫学的手法でCTCを特異的に濃縮するために用いられている抗EpCAM抗体は、EpCAM発現量が低いCTC種を検出できないことが問題となっている。そこで我々は、検体から採取した白血球内に極微量に存在するCTCを、できる限りロスや損傷なく標本化できるマイクロチャンバー型細胞チップと高感度蛍光検出システムを基礎とした方式(細胞チップマイクロチャンバー方式)を開発してきた。
本事業では、上記方式を実用化すべく、細胞チップマイクロチャンバー方式の自動化システムの開発、細胞チップと試薬処方を含めたプロトコールの開発、および臨床検体でシステムの性能実証を行った。
自動化システムは、細胞の標本化と蛍光免疫染色を行う反応部装置と細胞蛍光情報を取得する検出部装置および検出した細胞蛍光情報の画像処理・解析ソフトから構成される。反応部装置は、細胞を標本化・染色するための送液ポンプやポンプ移動機能、試薬ホルダなどを搭載し、検出部装置は、細胞輝度情報を高速に取得できるスキャンユニットと撮像ユニットで構成される。自動化システムは、平成22年度-平成24年度に、プロトI装置の試作を通してコア技術を確立し、検出性能と自動化機能を向上したプロトII装置を試作した。更に、低輝度のCTCを自動抽出するアルゴリズムと目視判定用のGUIを組合せた画像処理・解析ソフトを開発した。本ソフトにより、数百万個オーダーの白血球中に存在する数個レベルのCTCを1時間程度で判定することを可能とした。
プロトコールについては、高回収率かつ高集積度で細胞を標本化できる細胞チップデバイスを開発・試作し、サイトケラチン(CK)発現量が少なく低輝度な細胞の識別を実現する細胞染色処方を導出した後、検査作業手順の標準化を進めた。健常者血液にがん細胞をスパイクした検体を用いた検証により、血液中の10個レベルの細胞を高感度かつ安定に定量できることを示した。
本システムの臨床検体での性能を、乳がん患者検体を対象に評価した。2施設14検体の乳がん患者検体を対象に現在唯一のFDA承認装置であるCellSearchシステムと検出結果の比較を実施した結果、全ての検体でCellSearch以上のCTCを検出できる性能を示すことができた。また、CTC上の分子性状マーカーとして、乳がんの分子標的薬投与判断で重要なHer2免疫染色検査の検討を進め、CTC染色とともにHer2分子性状識別を可能とする染色プロトコールを確立し、将来のニーズに対する測定法の拡張性も示した。
英文要約Title: Development of Automatic Testing System for Genetic Diagnosis using Peripheral Blood (FY2010-FY2014) Final Report

Circulating tumor cells (CTCs) have been detected in the various cancerous patients’ blood, especially metastatic cancer patients’. Since CTCs are very rare in blood and high sensitive detection methods are demanded. To detect CTCs, most methods employ isolation of CTCs using anti-EpCAM antibody. However, recent reports revealed that some kind of CTCs lack EpCAM expression and they cannot be captured through current methods. To detect whole CTCs, including CTCs with weak or no EpCAM expression, we have developed a micro-chamber cell detection system with micro-chamber cell chips and high-sensitive fluorescence imaging, which can capture and keep CTCs with little loss and damage without depending on surface antigen.
In this project, we have developed an automated detection system, micro-chamber cell chips, immunostaining protocols, and evaluated our system by using patient’s blood.
We developed automated system which consists of the preparation component for the sampling and immunostaining on micro-chamber cell chips, the detection component for fluorescence measurements, and the analysis component for image processing and enumerating. The sample preparation component consists of a pump for cell-alignment and reagent reservoirs. The detection component consists of imaging equipment and a scanning stage. From 2012 to 2014, key technologies was designed and assembled through the fabrication of the first prototype system. Based on these results, we fabricated the second prototype which achieved more sensitive and automatic fluorescent detection. Furthermore, image processing and enumerating software was developed which can detect low levels of cytokeratin expression labeled with fluorescence and give its results in the human-friendly formats. This software makes it possible to find few CTCs in millions of white blood cells and enumerate them about one hour.
We developed the micro-chamber cell chips in order to capture cells efficiently and form monolayers densely. Immunostaining protocol was modified in order to detect CTCs expressing low levels of cytokeratin. The final protocol was recorded as standard operating procedure. To evaluate assay sensitivity, we demonstrated recovery rate of cancer cells in different cell lines spiked into healthy control blood. Our system was able to enumerate cancer cells with high reproducibility even when few cancer cells were in blood.
We evaluated the performance of our system by 14 breast cancer patients and the results were compared with FDA-approved CellSearch system. The result showed our system was able to detect more CTCs than CellSearch in all samples. In addition, we demonstrated the molecular characterization of CTCs with HER2 immunostaining, which is important to identify particular therapeutic target. The results show that our system can evaluate the molecular profile of each CTCs as well as the number of CTCs.
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