成果報告書詳細
管理番号20150000000597
タイトル平成26年度成果報告書 「体液中マイクロRNA測定技術基盤開発」
公開日2015/8/13
報告書年度2014 - 2014
委託先名独立行政法人国立がん研究センター 独立行政法人国立長寿医療研究センター 株式会社東芝 東レ株式会社 特定非営利活動法人バイオチップコンソーシアム プレシジョン・システム・サイエンス株式会社 国立大学法人京都工芸繊維大学 アークレイ株式会社 一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム
プロジェクト番号P14028
部署名ロボット・機械システム部
和文要約平成26年度成果報告書 「体液中マイクロRNA測定技術基盤開発」

I. 患者体液中miRNAの網羅的解析 
NCC、NCGG等によって収集された血清7,528検体について全miRNAを抽出し、高感度DNAチップによる網羅的(2,567種)miRNA解析を実施した。特に乳がん約1,600検体の解析、認知症約1,700検体の解析を終了し、miRNA発現データを取得した。倫理審査、解析拠点およびSOP等の整備が実施され、最終目標の達成に向けた体制を整えることができた。
II. 疾患横断的に解析可能なmiRNA発現データベースの構築 
miRNA解析データ収納用データベース開発について、初期データ集積のためのシステム立ち上げを完了し、さらに解析データの保管に特化した初期データベースの導入を完了した。並行して要件定義と開発のための組織体制を構築し、開発の基本方針についての合意形成を行った。標準物質の開発については、測定プロセスを前処理のプロセスと独立に評価するための実験系をデザインし、直接蛍光ラベルしたRNAを合成して、プラットフォーム評価用基礎データを収集した
会員規約等の整備を行いユーザーフォーラムを設立し、「ユーザーフォーラム説明会」を開催した。11月より入会受付を開始し、現在34社の入会が承認された。会員企業の一部に入会の目的及び期待する情報等についてヒアリングを行い、その要約を開発元メンバーへ報告した。本プロジェクトのHP(www.microrna.jp)を開設し、ユーザーフォーラムを含めプロジェクト情報を発信した。
III. miRNA診断マーカーとmiRNA検査/診断技術の開発
乳がんについて、本プロジェクトで収集、解析した血清中miRNAの網羅的発現データを用いて先行研究の成果の大規模検証を行い、乳がんと健康人を判別することができる血中miRNAを複数同定した。さらにmiRNAを複数組み合わせることによって、判別性能が上昇することを見出した。今後の解析によって基本計画に示された性能を超える乳がん検出法を確定することが、早期に可能と考えている。またNCC 共同研究先8 大学の検体によって、上記診断用miRNAの検証のみならず、同定されたmiRNA の生物学的意義の評価も可能になる。
VI. 臨床現場での使用に向けた検査システムの開発
<東レ>miRNA解析の全自動化を2015年度末に達成すべく、抽出、精製、蛍光標識の各工程の自動化装置プロトタイプを製作した。また、洗浄・乾燥工程検討用の試作装置を製作した。
<東芝>miRNAの抽出から検出までを全自動で行うシステムの開発を目指し、今年度はmiRNAの簡易抽出技術およびLAMP増幅技術を開発すると共に全自動デバイスの概念設計を完了させた。
<アークレイ/京都工芸繊維大>全自動miRNA測定システムに必要な、「体液からのmiRNA抽出」、「ターゲットの固相担体へのハイブリダイズ」、「ターゲットの遠心濃縮」、「蛍光測定」の4要素技術原理の確立を目指して検討を行った。結果、ターゲットの遠心濃縮、蛍光測定の原理を確立することができた。
<PSS/JBIC> (1)抗体を用いた体液からのエクソソームの分離、(2)試料からのmiRNA抽出、(3) 抽出したmiRNAの検出、の各反応の初期検討を行い良好な結果を得た。また、これらの各工程はすでに自社の既存技術 (geneLEAD XII plus) を用いて自動化が可能であり、臨床の現場での使用に適した診断システムの開発への活用が期待される。
英文要約I. Analysis of circulating miRNAs in serum
Serum miRNAs were extracted from 7,528 samples, and the miRNA expression profile was analyzed with a highly sensitive microarray, which can detect 2,567 human miRNAs. Especially, approximately 1,600 breast cancer serums in NCC and 1,700 dementia serums in NCGG have been analyzed. The ethical review application was approved, and the environment for analysis and SOPs were adjusted.
II. Construction of a database for cross-disease analysis
An initial computer system has been launched; the first version has been introduced to the project and been discussed with researchers. To develop the standard material for miRNA analysis, experiments have been designed to evaluate the measurement system independent of the pre-examination steps. Basic data have been collected from synthesized and directly labeled RNA.
We established a user forum for translating the research outcome to industrial communities. The user forum consisted of 34 member companies in March 2015. The project web page (www.microrna.jp) has been opened and disclosed information about the research and the user forum.
III. Development of diagnostic miRNA markers and discrimination technology
For discriminating breast cancer from a healthy control, large-scale validation of the previous studies has been carried out, and some miRNA markers have been validated. Furthermore, performance of the discriminant was improved by a combination of multiple miRNA markers. We consider that the goal for the basic plan could be established in the near future. Eight universities collaborated, not only to validate miRNA markers but also to analyze their biological significance.
IV. Development of tools for use in clinical practice
Toray: We developed prototype machines for the extraction, purification, and
label of miRNAs. Also, an automated system for washing and drying DNA chips was conceptualized and designed.
Toshiba: We developed technology for extracting miRNA from serum and technology for amplifying miRNA using the LAMP reaction. Furthermore, we completed the conceptual design of the device for automatic miRNA detection.
ARKRAY/Kyoto Institute of Technology: The goal was to establish four key methods in the first year: 1. miRNA extraction from a body fluid, 2. specific hybridization for targeting miRNA, 3. centrifugal concentration of the target, and 4. fluorescent measurement. We have successfully established methods for 3 and 4. Although significant progress has been made toward establishing 1 and 2, they are still under evaluation for an optimum system.
PSS/JBIC: We have conducted feasibility studies for 1. separating miRNAs from human serum using an antibody and magnetic beads, 2. extracting miRNA from samples using nucleic acid extraction reagents produced by PSS, and 3. trying to detect miRNA using the fully automated real-time PCR platform “geneLEAD XII plus.” The results of these feasibility tests showed that the detection of miRNA looks promising.
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