成果報告書詳細
管理番号20150000000713
タイトル平成23年度-平成26年度成果報告書 バイオマスエネルギー技術研究開発 戦略的次世代バイオマスエネルギー利用技術開発事業 (次世代技術開発) 油分生産性の優れた微細藻類の育種・改良技術の研究開発
公開日2015/10/2
報告書年度2011 - 2014
委託先名株式会社デンソー 学校法人中央大学
プロジェクト番号P10010
部署名新エネルギー部
和文要約単細胞緑藻Pseudococcomyxa属に適用できる遺伝子組換え技術の高度化とそれを利用した油脂生産性改良を目的として以下の研究を行った。
1)有用形質を持つPseudococcomyxa属突然変異体のゲノム解析
 Pseudococcomyxa ellipsoidea Obi株の精密ゲノム配列解析と、Pseudococcomyxa sp. KJ株のドラフトゲノム配列解析を行った。これらの配列はお互いに類似しており、両者とも総塩基長が約50 Mb、予測された遺伝子数が約1万であった。
 Obi株あるいはKJ株をN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジンで処理して得られた変異株のゲノム解析(resequencing)を行い、原因遺伝子を同定した。例えば、Obi株由来の高油脂蓄積変異体には、dual-specificity tyrosine phosphorylation regulated protein kinase(DYRK)をコードする遺伝子に変異が見いだされた。
2)形質転換効率の改良
 パーティクルガンを用いたKJ株およびObi株の形質転換効率(形質転換体数/形質転換に用いた細胞数)は、直径0.6ミクロンの金粒子を用いた時、平均で1X10-8であったが、直径0.3ミクロンの金粒子を用いた時h、平均で2X10-7であった。さらに、エレクトロポレーションの条件を検討し、平均で7X10-6の形質転換率を得た。
3)遺伝子ノックダウン・ノックアウト技術の開発
 Obi株のADP glucose pyrophosphorylase遺伝子を、TALENを用いてノックアウトした。ノックアウト株ではデンプン含量が減少し、油脂含量が増加した。KJ株のDYRK遺伝子の発現制御をRNAiによって行った。DYRK配列を持つヘアピンRNAをコードするDNAを、EF1α遺伝子のプロモーターとターミネーターとの間にクローン化し、KJ株に導入した。導入株では、DYRK mRNAの蓄積量が50-80%減少し、油脂含量が増加した。
4)セルフクローニングシステムの構築
 Obi株およびKJ株のウラシル要求性株(UMPS欠損株)を分離した。Obi株あるいはKJ株由来のUMPS cDNAを RubisCO small subunit遺伝子(RBCS)あるいはelongation factor alpha遺伝子(EFα)のプロモーターとターミネーターとに間に挟んだ発現コンストラクトを作製した。これらを使用して形質転換体を選択(Ura-→Ura+)する系を開発した。さらに、Cre/loxP活性を利用して、Ura+形質転換株からUMPS cDNAを特異的に切り出しUra-株に戻すことにも成功した。
5)油分生産効率が増加した組換え体の創生
 デンプンの分解に働くα-glucosidase(AGL1)、葉緑体での脂肪酸合成経路の最終段階で働くacyl-ACP thioesterase(FAT1)、細胞内に蓄積される油脂の大部分を占めるトリアシルグリセロールの合成に働くdiacylglycerol O-acyltransferase(DGAT2;4)それぞれのcDNAをKJ株内で同時に高発現させることにより、油脂生産性が約1.7倍に増加した。
6)導入遺伝子(transgene)を安定発現させる技術開発
 Obi株のRubisCO遺伝子など、KJ株のEF1α遺伝子などのプロモーターを用いることにより、Obi株、KJ株の中でtransgenesを安定的に発現させることができた。
英文要約For the sake of molecular breeding of unicellular green algae belonging to the genus Pseudococcomyxa, we developed tools for recombinant DNA technologies applicable to this genus.
1) Genomic analyses of Pseudococcomyxa strains
We conducted the whole genome sequencing of Pseudococcomyxa ellipsoidea strain Obi, and Pseudococcomyxa sp. stain KJ. We also conducted resequencing of the genomes of Pseudococcomyxa mutants with useful traits, and identified causative mutations. For example, a hyper-oil-producing phenotype was provoked by the mutation in the gene coding for a dual-specificity tyrosine phosphorylation regulated protein kinase (DYRK).
2) Improving genetic transformation efficiency in Pseudococcomyxa strains
Genetic transformation efficiency measured by the number of transformants per cell in Pseudococcomyxa strains had been very low being 10-8 per cell with biolistic bombardment with gold particles of 0.6 μm in diameter. We found that the efficiency increased to 2 × 10-7 per cell with 0.3 μm gold particles. Furthermore, we found conditions with which transformants were obtained by the electroporation at an efficiency of 7 × 10-6 per cell.
3) Gene knockout and knock-down
The ADP glucose pyrophosphorylase gene of strain Obi was knocked out by using the TALEN genome engineering technology. The starch content decreased while the lipid content increased in the knock-out strain.
The RNAi-mediated knockdown of the DYRK gene in strain KJ was also carried. In the transformants of strain KJ harboring a DYRK-RNAi transgene, the level of DYRK mRNA decreased, while the lipid contents increased.
4) Development of self-cloning systems
Auxotrophic mutants of strains Obi and KJ defective in UMP synthase (UMPS), hence requiring uracil for grown, were isolated. The UMPS cDNAs derived from strains Obi and KJ were cloned under the control of the RBCS (coding for the RubisCO small subunit) promoter and the EFα (coding for the elongation factor alpha) promoter, respectively. Using the UMPS cDNA expression constructs flanked by two loxP sequences, it was possible to transform, at a reasonably high frequency, the uracil auxotrophic strains into prototrophs (Ura- to Ura+). Furthermore, the Ura+ transformants were successfully converted into Ura- by the transient expression of the gene for the Cre recombinase. Thus, the Ura+ selection can be used repeatedly in the organisms.
5) Construction of hyper-lipid-produding recombinant strains of strain KJ
When the α-glucosidase gene involved in the starch degradation, the acyl-ACP thioesterase gene involved in the fatty acid synthesis in the chloroplast, and the diacylglycerol O-acyltransferase gene involved in the synthesis of triacylglycerol were collectively overexpressed in strain KJ, the lipid productivity increased by 70%.
6) Promoter useful for stable expression of transgenes
The EF1α promoter was useful for high and stable expression of trangens in strain KJ.
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