成果報告書詳細
管理番号20150000000757
タイトル平成22年度‐平成26年度成果報告書 「がん超早期診断・治療機器の総合研究開発 超早期高精度診断システムの研究開発:血液中のがん分子・遺伝子診断を実現するための技術・システムの研究開発 血中分子・遺伝子診断自動化システムの研究開発 (血中循環がん細胞検出技術)」
公開日2015/11/21
報告書年度2010 - 2014
委託先名東ソー株式会社
プロジェクト番号P10003
部署名ロボット・機械システム部
和文要約血中循環がん細胞検出技術(誘電泳動細胞固定方式)として、(1)血液前処理、(2)微細孔への細胞固定、(3)CTCの標識と検出、(4)CTCの採取の4工程からなる検出技術を開発した。下記工程の概要を以下に示す。
(1)血液前処理
血液中で大部分を占める赤血球を排除しCTCを濃縮するため密度勾配遠心法を利用した。また白血球を除去するために、赤血球と白血球を結合させる抗体からなる試薬(RosetteSep、STEMCELL社製)を血液前処理時に添加する事で、残留白血球数を100万個以下に削減し、がん細胞回収率95%(培養がん細胞株)を実現した。
(2)微細孔への細胞固定
がん細胞径と同等の大きさの微細孔(直径30マイクロメートル、深さ30‐40マイクロメートル、微細孔間隔50マイクロメートル)に設計した微細孔基板からなる診断チップを設計し、誘電泳動により微細孔へのがん細胞固定率95%を達成した。
(3)CTCの標識と検出
がん細胞をFITC蛍光標識した抗CK抗体でラベルし検出した。また混在している白血球はCD45をPE蛍光標識した抗CD45抗体でラベルしCTCと識別した。更に、細胞か非細胞(混入した細胞断片やゴミ)かを区別するため、細胞の核を染色するDAPI(紫外波長の蛍光を発する)を用いた。すなわち、CK陽性かつCD45陰性かつDAPI陽性の細胞をCTCとして判定した。
(4)CTCの採取
検出動作が終了した後、検出容器の蓋を外して再度検出システムのステージに設置し、パソコン上の画面で検出したCTCを選ぶことで、自動的にCTCを再度顕微鏡で捉え、ステージに搭載した細胞採取機構(吸引ポンプ式の精密ピペット)によってCTCを1細胞単位で採取する事を可能とした。
以上の工程からなるCTC検出技術を確立し試作装置を完成させた。本試作装置を評価したところ、モデル検体(健常者の血液に培養したがん細胞株を混入させた検体、がん細胞株として、乳がん細胞:SK-BR-3、肺がん細胞:PC9用いた)を用いて、検出率約80‐90%(目標値70%)を得た。また健常者からの検出は無かった。
また、培養がん細胞株(肺がん細胞:H1975)を用いて、1細胞ごとの検出、採取、遺伝子解析を行ったところ、本培養がん細胞株の持つ遺伝子変異(EGFR遺伝子のL858R変異及び、T790M変異)の検出に成功した。
更に、上記試作装置を病院や大学に設置し臨床検体を用いたCTC検出と遺伝子変異検出を行った結果、乳がん、肺がん、胃がんにおいて、CTCの可能性のある異常細胞の検出に成功し、がん患者の血液3mLの中に存在する10個程度のがん細胞を1細胞単位で検出する事を確認した。また検出した異常細胞のいくつかを1細胞ごと採取し、次世代シーケンサーを用いてがん関連遺伝子の遺伝子変異を確認した事から、検出した異常細胞ががん細胞(CTC)であると確認した。
英文要約We have developed a novel detection system for Circulating Tumor Cell (CTC) using dielectrophoretic trapping of cells into micropores.
This system comprises (1) enrichment of mononuclear cells from blood, (2) trapping of cells into the micropores by dielectrophoretic force,(3)labeling and detection of CTC,(4) picking up a single CTC from micropore and genetic analysis of CTC
(1) enrichment of mononuclear cells from blood
We have modified the enrichment protocol with a density gradient centrifugation method to isolate cancer cells from peripheral blood, with the result that recovery rate was about 95% regardless of type of cancer cells and the residual white blood cells are less than 1 million.
(2) trapping of cells into the micropores by dielectrophoretic force
Formation of micropores(diameter:30micrometer,depth:40micrometer,interval:50micrometer, 300 thousand micropores) on the insulating membrane, located in the lower electrode of the planer electrodes for the CTC detection chamber, and manipulating and fixating object cells onto those micropores by dielectrophoretic force generated by the electric field concentration at the said micropores. The fixability of cells is about 95%.
(3) labeling and detection of CTC
We labeled cells with DAPI, FITC-anti-cytokeratin (CK), PE-anti-CD45 antibodies, and detected by image-based analysis using a fluorescence microscope.
Then, the DAPI+, CK+, CD45- cells were detected as CTCs.
(4) picking up a single CTC from micropore and genetic analysis of CTC
We have picked up the CTCs by micropipette and we have also established a technique to sample single cells which are considered as CTC, and to find mutations in genome of the sampled single cells with DNA amplification by PCR technique.
Then we have fabricated a prototype system for research use. With the above protocol and a prototype system, we have detected cancer cells from pseudo CTC containing blood (3mL of peripheral blood spiked with 10~1000 cells, for example SKBR3 breast cancer cells, SK-BR-3 breast cancer cells, PC9 non-small cell lung cancer), with the result that average detection rate was about 80~90%.
Isolation of single captured tumor cell (H1975 :non-small cell lung cancer) followed by the detection of EGFR mutations was detected using sanger-sequencing.
Furthermore, we have operated a clinical trial in which 3 mL of peripheral blood samples from metastatic breast cancer patients, lung cancer patients and gastric cancer patients were measured. As a result, we have detected CTCs from each blood samples. In addition, genomic analyses of amplified genome from collected single CTCs found mutations in a number of cancer related genes.
Meanwhile, individual measurements of blood samples from healthy donors resulted in no false-positive detection.
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