成果報告書詳細
管理番号20150000000123
タイトル平成25年度ー平成26年度成果報告書 がん超早期診断・治療機器の総合研究開発 超早期高精度診断システムの研究開発:血液中のがん分子・遺伝子診断を実現するための技術・システムの研究開発 血中分子・遺伝子診断のための基礎技術の研究開発 (がんの発症を予測するシステムの開発 小型診断用質量分析装置の開発によるエクソソーム診断)
公開日2016/2/20
報告書年度2013 - 2014
委託先名塩野義製薬株式会社
プロジェクト番号P10004
部署名ロボット・機械システム部
和文要約国立がん研究センターにおけるヒト大腸癌細胞株とヒト正常大腸細胞とのプロテオーム解析より、大腸癌細胞に由来するエクソソームに特異的に存在するエクソソーム表面抗原としてCD147が同定された。市販の抗CD147抗体を用いたエクソスクリーン解析により、大腸癌患者末梢血においても、CD9陽性CD147陽性のエクソソームが検出され、このエクソソームが新たな大腸癌診断のマーカーになることが示唆された。我々は既に高性能な抗CD9モノクローナル抗体を取得していたので、今回は市販品を上回る高性能な抗CD147抗体を作製した。自製抗CD9抗体および自製抗CD147抗体によるサンドイッチELISAを作製し培養癌細胞株に由来するエクソソームに対する検出感度を検討したところ、市販抗CD147抗体の最小検出感度が10μg/ml以上であるのに対し、自製抗CD147抗体では625ng/mlと高感度であり、さらに、この自製抗体をFab’化すると最小検出限度が156ng/mlまで改良された。これらの自製抗体はエクソスクリーン解析においても好成績を示し、特にFab’化した抗CD147抗体によるエクソスクリーン解析では、非特異的なシグナルの除去によりSN比が向上した。エピトープ・マッピングの結果、得られた自製抗体のいくつかは市販抗体とは異なるエピトープを認識していることが明らかとなった。こうして性能評価を行った自製抗CD9および抗CD147モノクローナル抗体を用いた免疫沈降法により、ヒト大腸癌細胞株HCT116およびヒト正常大腸細胞株CCD-18Coの培養上清からのCD9陽性CD147陽性のエクソソームの調製を試みたところ、大腸癌細胞株HCT116のみからCD9陽性CD147陽性のエクソソームが回収された。このエクソソームを株式会社iLACに送付し、新規質量分析装置の開発に供した。臨床現場での採血時や保存期間中での検体中でのエクソソームの安定性について、様々な条件下で検討したところ、血液検体中でのCD9陽性CD147陽性のエクソソームの定量値は経時的に低下する傾向があることが判明した。今後の臨床機関でのエクソソーム調製における注意点であると考えられた。
英文要約 Proteomics analysis of human colorectal carcinoma cells compared with human normal colorectal-derived cells was carried out at National Cancer Center and CD147 was identified as a surface antigen specifically expressed on colorectal carcinoma cell-derived exosomes. As an Exoscreen analysis using commercially available anti-CD147 antibody showed that CD9-positive/CD147-positive exosome exist in peripheral blood of colorectal cancer patients, the CD9-positive/CD147-positive exosome would be a useful diagnostic marker for colorectal cancer. Since we have already prepared the highly reactive anti-CD9 monoclonal antibody, we tried in this project to prepare the anti-CD147 monoclonal antibody which shows higher performance than commercially available antibodies. As a result, sandwich ELISA with monoclonal antibodies against CD9 and CD147 which are both established in our lab showed the minimum sensitivity of 625ng/ml to exosomes secreted from cultured cancer cells whereas the one with commercially available anti CD147 antibody has the minimum sensitivity of more than 10000ng/ml. Moreover, when Fab’ form of our anti CD147 antibody was applied to the ELISA, the minimum sensitivity was improved to 156ng/ml. Our antibodies showed good results also in Exoscreen assays. Especially Exoscreen with Fab’ form of anti-CD147 antibody decreased non-specific signals to show augmented S/N ratio. The epitope-mapping experiment indicated that some of our anti-CD147 antibodies have a distinct epitopes from one of a commercially available anti-CD147 antibody.Using our antibodies whose high performance was confirmed as described above, CD9-positive/CD147-positive exosomes were prepared by immunoprecipitation from the culture supernatant of colon cancer cell line HCT116 although we could not purify CD9-positive/CD147-positive exosomes from culture supernatant of normal colon cell line CCD-18Co. The purified CD9-positive/CD147-positive exosomes were sent to iLAC Co., Ltd. to be used in the development of a recent model of a mass spectrometer.Stability of exosome after taking blood samples or during freeze preservation of serum was studied. The signals after various stock conditions tended to decrease time-dependently. Storing exosomes for a long time should be avoided to prevent the degradation of their surface proteins.
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