成果報告書詳細
管理番号20150000000850
タイトル平成22年度ー平成26年度成果報告書 「次世代機能代替技術の研究開発 次世代再生医療技術の研究開発 生体内で自己組織の再生を促すセルフリー型再生デバイスの開発 幹細胞ニッチ制御による自己組織再生型心血管デバイスの基盤開発」
公開日2016/3/1
報告書年度2010 - 2014
委託先名国立大学法人大阪大学 ニプロ株式会社
プロジェクト番号P10004
部署名ロボット・機械システム部
和文要約(1)幹細胞ニッチの探索と再構築技術の開発                
1 幹細胞ニッチを構築する基底膜分子の同定とその機能評価
 EGFP標識保持細胞として心臓幹細胞を可視化する技術を開発し、この細胞が主に心外膜に局在することを明らかにした。EGFP標識保持細胞の近傍に発現するECM分子を網羅的に探索し、ラミニン-511とpolydomをニッチ分子候補として同定した。polydom上では、他のECMと比較して、EGFP保持細胞の増殖が有意に亢進することを見いだした。
2 増殖因子・分化誘導因子を組み込んだ人工幹細胞ニッチの構築
 心筋再生に関連するアクチビンおよびBMPファミリーの増殖因子とECM分子の結合を網羅的に検索し、アクチビンとBMP-2,4,7がパールカンとアグリンに結合することを見いだした。また、コラーゲンデバイス表面に心筋幹細胞ニッチ候補分子のpolydomおよびラミニンの活性断片を固相化する方法を開発した。
(2)幹細胞の誘導因子・分化促進の開発                  
1 幹細胞誘導因子の開発
 1)HMGB1の幹細胞誘導効果
  HMGB1は骨髄から間葉系幹細胞を動員し、かつその表面にONO-1301により誘導されるケモカインSDF-1アルファの受容体CXCR4発現を誘導し、ONO-1301含有心筋シート特異的間葉系幹細胞集積を誘導し得ること、集積した間葉系幹細胞は抗炎症分子TSG-6を発現して炎症反応を再生反応へと転換することが明らかとなった。
 2)ONO-1301徐放性マイクロスフェア製剤の心機能改善効果
  ONO-1301の4週間徐放性マイクロスフェア製剤(YS-1402)の製造方法を確立し、各種非臨床検討に必要な量を製造した。各種疾患モデル動物を用いて実施した薬効薬理試験等の非臨床試験結果を用いて、治験実施計画書、同意説明文書、及び治験概要書を作成し、治験開始のためのPMDA対面助言(戦P132)を実施した。
  大阪大学治験審査委員会(IRB)の審査を経て、治験届を提出し後、2015年6月より、医師主導での第I/IIa相治験として、「冠動脈バイパス手術を施行する虚血性心筋症患者 にYS-1402を単回投与した際の安全性、忍容性、及び有効性を検討する並行群間用量漸増試験」を開始する予定である。
2 分化誘導因子の開発
 心筋細胞分化誘導因子の一つと同定されたleukemia inhibitory factor(LIF)の効果を、in vivo genetic fate mapping の手法により調べたところ、マウス心筋梗塞領域に新生心筋が認められ、その一部はSide Population(SP)細胞を起源とすることが観察された。LIFは、出生前よりSP細胞の増殖、心筋分化を促すことが示唆された。さらに心筋梗塞後の心機能を改善するメカニズムを調べるために、ラットCryoinjury心臓モデルを作成しLIF徐放性ハイドロゲルを胸部に植え込むことにより心臓の修復組織の厚さが有意に増加し、神経突起の伸長も認められた。新生仔ラット上頚神経節由来神経細胞の特性に及ぼす効果は、心筋細胞-神経細胞の共培養系にLIFを添加すると、上頚神経節由来神経細胞の神経突起の伸長が促進することが判明し、神経細胞中のnestin陽性の神経幹細胞の割合が増大していた。これらの結果から、LIFは神経突起伸長作用と神経幹細胞の増生促進作用を有し、これらが心機能改善効果に寄与している可能性が示唆された。
(3)自己組織再生型心血管デバイスの開発                 1 幹細胞誘導因子のドラッグデリバリーシステムの開発
 臨床応用が可能な生体吸収性高分子を用いて、幹細胞誘導因子、ならびに分化誘導因子を徐放化することができるドラッグデリバリーシステム(DDS)技術を研究開発した。具体的には、ゼラチン、あるいはL-乳酸オリゴマーなどを化学導入したゼラチン誘導体などからなる生体吸収性ハイドロゲルを用いて、幹細胞誘導因子としてのONO-1301、stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)、HMGB1 A-boxペプチド、ならびに分化誘導因子としてのleukemia inhibitory factor(LIF)を徐放化させた。ハイドロゲルに含浸させた因子の徐放性とハイドロゲルの分解性とを調べたところ、含浸させた因子はハイドロゲルの分解とともに徐放化されることがわかった。
2 誘導した幹細胞を定着させるデバイスの開発
 幹細胞を定着させるデバイスとして、ゼラチンハイドロゲルを組み込んだ心筋ネットを作製することができた。
英文要約(1) Searching and restructuring of stem cell niche

A novel imaging protocol for identification of cardiac stem cells as EGFP label-retaining cells (EGFP-LRCs) was developed. Laminin-511 and polydom were found to closely associate with EGFP-LRCs and polydom was found to potentiate the growth of EGFP-LRCs, indicative of its role as the niche for cardiac stem cells. A novel technology that endows laminin fragments and polydom with the ability of binding to collagen devices was developed.


(2) Development of recruitment and differentiation factor of stem cell

1 Development of recruitment factor of stem cell

1) Effects of HMGB1 on Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

HMGB1 was shown to induce CXCR4 expression on the surface of the bone marrow-derived MSCs in vivo, resulting in accelerating MSC accumulation to the lesion of SDF-1 expression induced by ONO-1301 on the myocardial sheet-attached area. The lesion-accumulating MSCs were then shown to express potent anti-inflammatory molecule TSG-6 to suppress inflammatory reactions and induce regenerative reactions in the lesion.

2) Preparation and evaluation of ONO-1301 microsphere

We had established a method of manufacturing a 4-week sustained release microsphere preparation of ONO-1301 (YS-1402), and produced a quantity required for various non-clinical studies. Using results of non-clinical pharmacological studies etc. on various disease models using animals, various documents required to start clinical trial such as the research protocol, informed consent document, and a clinical trial Brochure were prepared. and then we conducted a face-to-face discussion with PMDA (SenP132) to get advice for the startup a clinical trial.
Through the examination of Osaka University Institutional Review Board (IRB) and the following submission of a clinical trial notification, the physician-led clinical trial (phaseI& early phaseIIrial) will be started from June 2015, as a dose escalation study between parallel-group with patients of ischemic cardiomyopathy who will be treated coronary artery bypass surgery to evaluate safety, tolerability, and efficacy by the single administration of YS-1402.

2 Development of differentiation factor of stem cell

In a genetic fate-mapping mouse model, leukemia inhibitory factor (LIF) proliferated cardiac side population (SP) cells and enhanced myocardial regeneration in part by activating SP cells after myocardial infarction. In cryojnjury of the rat hart model, the implantation of the gelatin hydrogels releasing LIF onto the epicardial surface of the ventricles increased thickness of reparative heart tissues and promoted neurite growth. Neonatal rat cardiac myocytes and superior cervical ganglion neuron cells were co-cultured with the application of LIF. As a result, fractions of stem neuron marker of nestin-positive axons were increased.
Based on these results we showed that LIF is a promising molecular target for regulation of cardiac function and regeneration in diseased hearts.


(3) Development of self-regenerative cardiovascular device

1 Development of drug delivery systems (DDS) for the controlled release of stem cell recruitment and differentiation factors

DDS for the controlled release of stem cell recruitment and differentiation factors were developed by making use of clinically applicable biodegradable polymers. In this research, gelatin or its derivatives, such as L-lactic acid oligomer-grafted gelatin, were employed as the biodegradable polymer to fabricate biodegradable hydrogels for the controlled release of stem cell recruitment factors, such as ONO-1301, stromal cell-derived factor-1 (SDF-1), HMGB1 A-box peptide, and stem cell differentiation factors, such as leukemia inhibitory factor (LIF).

2 Evaluation of release profile of stem cell recruitment and differentiation factors
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