成果報告書詳細
管理番号20160000000096
タイトル平成26年度成果報告書 国際基準化に向けた心毒性評価法確立のための細胞製造・計測技術の開発 心毒性評価用心筋細胞の大量製造技術・計測装置の開発 (3)
公開日2016/3/23
報告書年度2014 - 2014
委託先名タカラバイオ株式会社 国立大学法人京都大学
プロジェクト番号P14027
部署名ロボット・機械システム部
和文要約【事業概要】
 本研究開発では、京都大学 山下潤 教授の研究室で開発された高純度iPS細胞由来心筋細胞分化誘導技術を基に、高品質で均一なiPS細胞由来心筋細胞の商業的製造を前提とした大量培養技術の目処をつけることを目的とし、以下の項目を実施している。
【実施項目】
(1) 京都大学における心筋細胞分化誘導法・輸送方法・心毒性試験法の技術移管
京都大学 山下潤 教授の研究室で開発された高効率・高純度心筋細胞分化誘導法、並びに心筋細胞の輸送方法、心毒性評価試験方法の技術移転を開始し、同技術を習得するとともに、心筋細胞製造用のプロトタイプSOPを作成した。さらに、技術移転の最終段階において、プロトタイプSOPをもとにタカラバイオ社員が製造した心筋細胞を用いて、国衛研及び京都大学の2施設においてEー4031によるFPD(field potential duration)の延長を確認できたことにより、本研究開発の基盤となる技術を習得できたことを実験的に証明した。
(2) タカラバイオにおける心筋細胞分化誘導法の再現
上記技術移転と並行し、タカラバイオ施設において京都大学での心筋細胞誘導法を再現するための実験を開始した。用いるiPS細胞株としては、京都大学で使用している836B3株、及び製品化が比較的容易な253G1株を選定し、いずれの株においても京都大学と同等の効率・純度にて心筋細胞が製造出来ることを示した。とりわけ、253G1株が製造用細胞として使用できる可能性が確認できたことは、iPS細胞由来心筋細胞の製品化に大きく前進したと考えられた。
(3) 評価用プロトタイプ心筋細胞の製造及び供給体制の構築
タカラバイオ施設にてプロトタイプ心筋細胞を製造し、国衛研及び京都大学へ心毒性評価試験用として輸送した。計2回の心毒性評価試験を実施したところ、いずれのロットにおいても拍動数が低く、心毒性評価試験には不適であることが確認された。すなわち、高品質の心筋細胞を製造するためには、製造条件の至適化が必要であることが示され、現在拍動数改善に向けた検討を行っているところである。一方、心毒性評価用プローブ上で製造した心筋細胞を長期培養することで拍動数が改善することもあり、タカラバイオで行った試験においては、Eー4031及びクロマノールに対する応答性、及び高濃度(300nM)Eー4031添加条件におけるEAD様の波形が確認出来た。この濃度でのEAD様波形の検出は従来知られているiPS細胞由来心筋細胞より高く、本誘導法で作製される心筋細胞の特徴である可能性が示唆された。
また、製造の中間段階で実施している心筋前駆細胞の純化工程において、マーカーの発現量が製造毎に異なること、その発現量の違いは細胞の純化効率に影響すること、フィーダーフリー化毎に発現量が大きく異なること、を明らかにした。すなわち、本心筋細胞の製造工程における重要因子として、従来の心筋細胞の純度・製造効率に加え、分化誘導前のiPS細胞の未分化状態、分化誘導の中間段階における心筋前駆細胞マーカー発現量、分化誘導後の心筋細胞の拍動数、が抽出されたといえる。今後は、各段階において管理値を設定するとともに、管理値を達成するために重要となる因子を探索することで、安定的に高品質の心筋細胞製造工程が確立できる見込みである。また、製品化のための製造に際しては、その安定性に加えて、大量生産性が必要となるが、我々は律速工程となる心筋前駆細胞の純化工程について条件の最適化を行い、従来の約1.7倍のスケールでの製造が可能であることを明らかにした。
英文要約Title: Beyond the Fusion of Academia and Industry in Japan: an Integrated System for High Quality and Large Scale Production of Differentiated Cardiomyocytes (CMs) Derived from hiPSCs, based on the system developed at Laboratory of stem cell differentiation, CiRA at Kyoto Univ. in Japan.
The TAKARA BIO Inc. plays the following roles:
1. Technology transfer; the method of differentiation, transportation, and toxicity test for CMs.
The production, transportation and functional analysis method for CMs were acquired. Then, prototype of SOPs (standard operating procedure) was written based on the efficient differentiation protocol into pure CMs developed at CiRA. The CMs were produced by the member from TAKARA BIO at CiRA in according to the prototypic SOPs and confirmed that >95% of CMs were cardiac troponin T positive cells. The CMs were transported from CiRA to NIHS and affirmed the QT prolongation caused by E-4031, potassium channel blocker, at both sites. By the result of the purity and functional analysis at two facilities, we confirmed the technology transfer was successfully achieved.
2. Creation of the CMs at TAKARA BIO
The CMs were produced at TAKARA BIO in according to the prototypic SOPs. The CM production trial was started by using two iPS cell lines; 836B3, same as CiRA; 253G1, the commercially available cell line, and we have successfully differentiated as pure CMs as produced at CiRA. The verification of pure-CM differentiated from 253G1 would be big advantage for CM commercialization.
3. Production of the prototypical CMs and assessed them
The prototypical CMs differentiated from iPS cells were transported twice to analyze electrical function by MED64 systems at CiRA and NIHS first, then at CiRA, NIHS and Takara. Although purity of the CMs was over 95% in terms of cTnT expressing ratio, the CM quality was not optimal for cardiac toxicology test due to their low beating frequency in both two trials. This result suggests that the optimization of the protocols for cardiac differentiation was needed. On the other hand, the CMs on MED probe were improved their heart rate by long cultivation. Those cells were tested for cardiac toxicology in TAKARA BIO and successfully responded to potassium channel blocker, both E-4031 and Chromanol, and detected EAD (early after de-poralization) -like signal at 300nM E-4031. The concentration detected EAD-like signal by our CMs was higher than it by iPSC-derived CMs by other vendors. This indicates that the CMs produced by our method may have some different characters.
Furthermore, we cleared that the expression levels of a marker for cardiac progenitor cells were varied in each lot of the iPSc cultured in feeder-free condition, which affect isolation efficiencies of cardiac progenitor cells.
In this year, through the several experiments, we extracted the point for consideration; the necessity of optimization protocols for not only purity and efficiency of CMs but also quality of the iPSc cultured in feeder-free conditions before induction of differentiation, expression levels of a marker for cardiac progenitor at purification step of the cells and beating frequency of the CMs. In the near future it will be needed to lay down specification values, and discover the factors affecting those for stable CM production. Furthermore, purification capacity of our optimized condition was 1.7 folds higher than those of conventional one at purification process that is a rate-determining step.
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