成果報告書詳細
管理番号20160000000368
タイトル平成24年度-平成27年度成果報告書 バイオマスエネルギー技術研究開発 戦略的次世代バイオマスエネルギー利用技術開発事業(次世代技術開発)海洋性緑藻による油脂生産技術の研究開発
公開日2016/8/26
報告書年度2012 - 2015
委託先名国立大学法人神戸大学 大学共同利用機関法人自然科学研究機構基礎生物学研究所 DIC株式会社
プロジェクト番号P10010
部署名新エネルギー部
和文要約本研究開発で用いるオイル生産性緑藻株のゲノム配列を次世代シーケンサーによって決定した。その結果得られた18S rRNA配列を比較解析したところ、過去に報告のない新規株であることが判明し、Chlamydomonas sp. JSC4株と命名した。Chlamydomonas sp. JSC4株を培養する際、窒素欠乏時に海水塩を培地に添加することで油脂蓄積を強く誘導できることを解明した。Chlamydomonas sp. JSC4株の代謝解析と遺伝子発現解析を実施し、海水塩添加時にはデンプン合成から油脂合成に代謝がシフトし、デンプンを分解して油脂合成に利用することを見出した。また銅や酢酸の添加によっても油脂蓄積量が増加することを発見した。一方で、Chlamydomonas sp. JSC4株を明暗周期下で培養した時に油脂含有率が低下することが課題として明らかになった。その解決手段として、暗期時における弱光照射技術を開発した。
Chlamydomonas sp. JSC4株をDIC(株)の子会社Earthrise Nutritionals社(米国カリフォルニア州)に設置した屋外池にて連続培養し、生育速度、光合成機能、気象パラメータ等の連続測定試験を行った。その結果、日の出直後に大きな過剰光ストレスが加わるために、日中の光合成量子収率が著しく低下していることが明らかとなった。さらにコンピュータによる気象制御にて室内にて屋外環境を再現する実験系を確立した。室内実験にて光合成の機能を解析した結果、微細藻類屋外培養の生育ボトルネックは、夜間の低温、および日中の紫外線によることが明らかとなった。
Chlamydomonas sp. JSC4株の屋外大量培養技術の開発を、Earthrise Nutritionals社に設置したレースウエイ型50 m2屋外池でおこなった。当初ツボカビの一種であるキトリッドの寄生により培養が困難であったが、改変HSM培地に塩分を適量添加することで寄生を抑制することが可能となり、1ヶ月の半連続培養に成功した。次に、窒素欠乏条件によるバッチ式の油脂生産培養を検討した。神戸大での成果を基に海水塩を培地に添加することで、11 g/m3/dayの油脂生産速度を得たが、残念ながら目標の90 g/m3/dayには及ばなかった。その原因は、屋外培養ではラボとは異なり、油脂の代わりにデンプンを大量に蓄積するためと判明した。デンプンと油脂の代謝を制御・改変することが、今後の課題である。Chlamydomonas sp. JSC4株の代謝改変を目的として、コドンバイアスを適合させたパロモマイシン耐性遺伝子マーカーをHsp70Aプロモータ/ターミネータ系で発現させる形質転換ベクターを開発し、マルチパルスポレーターにより細胞内に導入し、同遺伝子のゲノム挿入形質転換株を、パロモマイシン耐性を指標に、選抜する手法を開発した。また進化工学的手法により、海水塩添加時や水温低下時におけるキトリッドの日和見感染を抑制することを目的として、Chlamydomonas sp. JSC4株から7%海水塩存在下でも健康的に生育可能な高塩濃度耐性株を創出した。同様に15℃における増殖能力が増強された低温耐性株を創出した。
Chlamydomonas sp. JSC4株による油脂生産コストを試算した。Vasudevan et al (2012)を基に、400 haの培養設備を用いて、増殖速度20 g/m2/dayで油脂含有率を60%まで高められれば(油脂生産性40 g/m3/day)、油脂生産コストは292円/Lになると試算された。
英文要約Title: Development of Biodiesel Production Technologies using the Oceanic Green Microalga Chlamydomonas sp. JSC4 (FY2012-FY2015) Final Report

We determined whole genome sequence of the oleaginous microalga used in this project by a next generation sequencer, and compared its 18S rRNA with that of other species. We found that this microalgal strain had been completely unidentified, and named it as Chlamydomonas sp. JSC4. By adding sea salt at nitrogen depletion condition, we can strongly induce lipid accumulation in Chlamydomonas sp. JSC4 cells. Metabolic profiling and gene expression analyses revealed that, in presence of sea salt, Chlamydomonas sp. JSC4 cells shift its metabolic pathway from starch production to lipid production, and produce lipid by decomposing starch. Supplying with copper ion and acetate also increased lipid content of Chlamydomonas sp. JSC4 cells. We found that lipid content of Chlamydomonas sp. JSC4 cells decreases under light/dark cycles. To solve this problem, we developed a dim light irradiation technique at dark periods.
Chlamydomonas sp. JSC4 were continuously cultured in outdoor ponds of Earthrise Nutritionals LLC (California, US), which is a subsidiary company of DIC Corporation, and cell growth, photosynthetic activity, and weather conditions, etc. were measured. We found that quantum yield of photosynthesis was severely decreased in day periods because of the excessive light stress immediately after dawn. We developed a computer-regulated indoor weather control cultivation system that precisely imitate outdoor environment. We analyzed photosynthesis activity using this system, and revealed that bottlenecks of cell growth under outdoor condition were the temperature decline at night periods and the strong UV irradiation at day periods.
We developed outdoor mass-cultivation techniques for Chlamydomonas sp. JSC4 using 50 m2 raceway ponds of Earthrise Nutritionals LLC. At the beginning of the project, contamination of a parasitic Chytridiomycota severely inhibited growth of Chlamydomonas sp. JSC4. By using modified HSM medium containing appropriate concentration of salts for the culture, we could suppress infection of the Chytridiomycota, and successfully sub-cultured Chlamydomonas sp. JSC4 for 1.5 months at the outdoor environment. Based on the result of Kobe University, we achieved lipid productivity of 11 g/m3/d by adding sea salt to the culture, but failed to achieved our first set value of 90 g/m3/d. The reason was that, different from Laboratory conditions, Chlamydomonas sp. JSC4 accumulated high content of starch instead of lipid. Therefore, our next goal is regulating / modifying the starch-lipid metabolism. In order to modify the metabolic pathway of Chlamydomonas sp. JSC4, transformation plasmid vectors that carries a paromomycin resistance gene with optimized codon usage bias and HSP70A promoter / terminator expression system were developed. We introduced this vector to Chlamydomonas sp. JSC4 cells by a multi-pulse electroporator, and successfully obtained transformants using paromomycin resistance as a marker. To suppress opportunistic infection of the Chytridiomycota when adding sea salt and temperature decline, salt-resistant strains that can grow healthy even in presence of 7% sea salt were generated by an evolutional engineering technique. Also, a cold-resistant strain that can grow well even at 15℃ was generated by natural habituation.
Cost for biodiesel production using Chlamydomonas sp. JSC4 was estimated based on Vasudevan et al. (2012). If we can achieve lipid content of 60% and biomass production of 20 g/m2/d (lipid productivity of 40 g/m3/d) at a 400 ha cultivation pond, cost for biodiesel production would be 292 yen/L.
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