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成果報告書詳細
管理番号20170000000397
タイトル平成26年度ー平成28年度成果報告書 エネルギー・環境新技術先導プログラム 生物・有機合成ハイブリッド微生物による100%グリーンジェット燃料生産技術の開発
公開日2017/7/6
報告書年度2014 - 2016
委託先名公益財団法人地球環境産業技術研究機構
プロジェクト番号P14004
部署名イノベーション推進部
和文要約1有機合成用触媒の細胞内における機能発現
 1年目には、これまでin vitroでの有機合成反応に用いられてきた有機合成用触媒を菌体内で機能発現させるため、ペプチド型擬似体のペプチド配列を複数種類デザインし、可溶性蛋白質と融合させてCorynebacterium glutamicumの菌体内で発現させた。各有機合成用触媒発現株についてセル反応を行った結果、数種類の発現株について有意に高い触媒活性が検出された。更にセル反応で活性が検出された擬似ペプチドについて大腸菌で発現させて精製しても触媒活性が検出された。天然に存在する有機合成用触媒についてそれらの生合成経路の導入によって高生産させたところ、菌体内の当該触媒の濃度が野生株より高くなり、セル反応でも顕著に高い活性が検出された。2年目には、前年度に得られたペプチド型擬似体についてペプチド配列の連結などの改良を試み、また新たな配列も検討したがこれらは効果がなかった。しかし天然に存在する有機合成用触媒を蓄積する株について生合成経路を更に強化した結果、触媒の菌体内における蓄積量が更に向上し、菌体の触媒活性も顕著に向上した。これにより本研究項目の目標である有機合成用触媒の細胞内における機能発現の実証に成功した。
2新規修飾酵素の探索
 目的の触媒反応によって生成する生合成中間体を特異的に修飾する酵素は知られていなかった。そこで類似の化合物を基質とする酵素の中から候補を選定し、それらのスクリーニングを行ったが、活性を示す酵素は得られなかった。しかし研究項目1において菌体内での機能発現に成功した触媒の中に、修飾反応も効率よく行えるものがあることが明らかとなり、これらを利用することで本研究項目は解決された。
3水素生産とカップリングさせた補酵素再生系の構築前駆体の生合成過程で余剰となる還元型補酵素を、ヒドロゲナーゼによる水素生産とカップリングさせて酸化型に再生させるため、2種類の[NiFe]-ヒドロゲナーゼのC. glutamicumにおける機能発現を試みた。1年目はヒドロゲナーゼ発現に必要なヒドロゲナーゼ蛋白質群、成熟化因子蛋白質群をコードする遺伝子群のクローニングを行い、2年目はこれらをC. glutamicumにおいて発現させた。その結果ヒドロゲナーゼ蛋白質の発現は確認されたが、プロセシングによる成熟化は検出できなかった。
4生物・有機合成ハイブリッド微生物の構築
 C. glutamicumに触媒反応の基質となる化合物の生合成経路を導入することによって目的のC10ジェット燃料前駆体の生産を検出し、グルコースからジェット燃料前駆体を生成させるという本研究項目の目標を達成した。更に本前駆体生産株では、予想した前駆体とは異なる化合物の生産も検出した。これらを単離・構造解析した結果、目的の触媒反応による生産物ではないが、ジェット燃料として利用可能である化合物であることを同定した。 
5国家プロジェクト化の検討
 各年度において年2回の推進委員会を開催した。またロードマップに基づいたグリーンジェット燃料製造までのマイルストーンも含めて、事業化構想を策定した。
英文要約1 Functional expression of chemical catalysts in microbial cells
 In the first year, to functionally express chemical catalysts in microbial cells, peptide-type mimics were expressed intracellularly in Corynebacterium glutamicum. Desired catalytic activity was analyzed in these recombinant C. glutamicum strains by cell-based assay, and was significantly detected in some of these strains. Apart from this, to accumulate naturally occurring catalyst intracellularly, their biosynthetic genes were introduced and overexpressed in C. glutamicum. The intracellular concentration of the chemical catalyst in this strain was much higher than that in wild type, and cell-based assay showed the significantly high activity desired in this strain. These results indicated that chemical catalysts used in organic synthesis were successfully expressed in microbial cells. In the second year, the peptide sequence of the active mimic was arranged to improve its activity and newly designed peptide-sequences were also examined, however, they had no effect. In contrast, by improving biosynthetic pathway, the naturally occurring chemical catalyst was further accumulated in the cell, and the cell activity was significantly elevated. We have successfully achieved a target of research issue 1 proving that it was possible that chemical catalysts were functionally expressed in microbial cells.
2 Screening of novel tailoring enzymes
 To obtain tailoring enzymes for intermediate compounds, some candidate enzymes whose inherent substrates were structurally close to them were examined, but none of them could modified intermediate compounds. However, chemical catalysts functionally expressed in the cell in research issue 1 were able to catalyze modification of these intermediate compounds as well. Thus, we have successfully achieved a target of research issue 2.
3 Cofactor-regeneration system coupled with hydrogen production
 In the biosynthesis of jet fuel precursors, reduced cofactor was excess. Thus, to regenerate oxidized cofactor, heterologous expression of either of two kinds of [NiFe]-hydrogenases in C. glutamicum was examined. Gene clusters encoding hydrogenase subunit proteins and maturation enzymes were cloned and introduced in C. glutamicum. As a result, expression of hydrogenase proteins was detected, however, maturation of them was remained to be confirmed.
4 Construction of hybrid microbe equipped with chemical catalyst
 By introduced with substrate biosynthetic genes, the C. glutamicum strain produced one of expected jet fuel precursor, C10 precursor, along with unknown compounds from glucose. Thus, we have partially achieved a target of research issue 4. Furthermore, the unknown compounds were structurally identified and was also found to be possible for jet fuel precursor.
5 Preparation for national project
 Promotion committee was held twice each year. Industrialization plan for green jet fuel production was developed.
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