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Press Release

高感度・低コストの抗体集積化チップを開発

―がんなどの疾病診断の信頼性が飛躍的に向上―
2012年9月13日
国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構
国立大学法人京都工芸繊維大学

 NEDOの若手グラント(産業技術研究助成事業)の一環として、免疫診断に使用する抗体の高感度化と製造コストの低減に取り組んでいる京都工芸繊維大学の熊田陽一助教は、高感度・低コストの抗体集積化チップの開発に成功しました。

 抗体チップの基板として使用するポリスチレン基板に、ポリスチレンと親和性の高い独自のタグを付加した「タグ付き単鎖抗体」を採用。抗体として動作する本来の立体構造を保持したまま、抗体チップ基板上に配列させることにより、がんなどの疾病に伴って発現する血液中のバイオマーカーの検出感度が従来の免疫診断法に比べ10倍以上向上することを実証。チップの製造コストも、大量生産が可能なことから、従来技術に比べ1/10以下のコストで済みます。
 また、高額な分析機器を使わないバイオマーカー糖鎖プロファイリング診断技術の開発にも成功。
 これらの成果により、疾病診断の信頼性が飛躍的に向上、重篤な疾病の早期発見にもつながることが期待されます。

  • 図1 バイオマーカーの検出方法
    図1 バイオマーカーの検出方法

 今回の成果については、熊田陽一助教が第11回産学官連携会議/イノベーションジャパン2012(9月27~28日、東京国際フォーラム)の「若手研究者による科学・技術研究説明会」で詳細に説明します。

1.概要

 将来の予防医療社会を考える上で、免疫診断(※1)に使用する抗体の高感度化と製造コストの低減は喫緊の課題です。これまで免疫診断に用いられてきた抗体(完全長抗体)は、製造コストがきわめて高く、免疫診断の価格高騰を引き起こしています。
 このような背景から、小サイズで、完全長抗体と同じ機能が期待できる単鎖抗体(※2)を用い、抗体チップ基板として使用するポリスチレン基板にしっかりと付着するタグを単鎖抗体の片方の末端に融合させて、単鎖抗体を高密度に、かつバイオマーカー(※3)の捕捉に適した配向方向の揃った状態で基板に固定化できないか検討しました。
 単鎖抗体は、従来の抗体と同等の抗原認識力を有し、組換え大腸菌で安価に生産可能なことから、次世代の診断用素子として利用が期待されています。単鎖抗体の分子サイズは、従来の抗体の1/5~1/6と極めて小さく、ポリスチレン等の材料基板上に高密度かつ安定に固定化できれば、免疫診断の大幅な低コスト化と高感度化が期待できます。しかし、通常、単鎖抗体を組換え大腸菌で生産した場合、その大部分が不溶で不活性な凝集体として回収され、抗原結合活性を回復するためには煩雑なリフォールディング操作(※4)を行う必要があります。さらに、リフォールディング操作によって抗原結合活性を回復しても、単鎖抗体を材料基板上に固定化した際に、基板表面との接触によって立体構造が変化し、抗原結合活性を著しく喪失することが実用化の大きな妨げとなっています。そこで、単鎖抗体の生産、リフォールディング、固定化プロセスを工学的視点から抜本的に改善し、極めて低コストで高パフォーマンスな診断用単鎖抗体固定化基板の製造技術を確立しました。(図2)さらには、本技術によって安価に製造された単鎖抗体固定化基板を用い、バイオマーカーの標識糖鎖を高感度に検出可能な糖鎖プロファイリング診断技術(※5)の開発に成功しました。

  • 図2 抗体集積化チップの製造工程例
    図2 抗体集積化チップの製造工程例

(1)プラスチック基板高親和性タグを単鎖抗体の片方の末端に付加させ、高感度化に成功

 ポリスチレン基板上に所望のタンパク質を高密度かつ均一な分子配向で固定化するためのペプチドタグ(※6)を開発しました。さらに、プロトタイプのタグをタンパク質の配向固定に適したアミノ酸配列に最適化することに成功しました。
 その結果、様々な機能性タンパク質にタグを付加させて、機能性タンパク質を高密度かつ高活性な状態で基板上に固定化することが可能となりました。特に、ポリスチレンに強固に付着するポリスチレンタグを付加させた「ポリスチレン高親和性タグ付き単鎖抗体」は、従来抗体と比較して50倍以上高密度な固定化が可能であり、その結果、免疫測定による検出感度を10倍以上高感度化できることを実証しました。(図3、図4)

  • 図3 完全長抗体とタグ付き単鎖抗体の構造
    図3 完全長抗体とタグ付き単鎖抗体の構造
  • 図4 タグ付き単鎖抗体の優位性
    図4 タグ付き単鎖抗体の優位性

(2)タグ付き単鎖抗体の低コスト、ハイスループット生産に成功

 多品種の単鎖抗体を同時に生産可能なハイスループット生産システムを開発しました。(図5左)ディープウェルプレートを高速で揺動させ、酸素供給を高めた環境下において組換え大腸菌を培養することにより、各ウェルから高純度で高濃度のタグ付き単鎖抗体を回収できることを実証しました。各ウェルにおけるタグ付き単鎖抗体生産性のバラツキはほとんどなく、安価に多品種のタグ付き単鎖抗体を極めて迅速に生産可能としました。(図5中)(1枚のディープウェルプレートで96種類のタグ付き単鎖抗体が生産可能。1ウェル当たりの生産濃度:約1g/L(図5右))
 各ウェル内に生産されたタグ付き単鎖抗体は、フィルタープレートを用いる精製(図2参照)によって高純度に精製された後、固相リフォールディング技術(下記(3)参照)によって診断用プレートやチップ基板上に固定化できます。

  • 図5 高速振とう培養機を用いるタグ付き単鎖抗体のハイスループット生産
    図5 高速振とう培養機を用いるタグ付き単鎖抗体のハイスループット生産

(3)煩雑かつ非効率的なリフォールディング操作の大幅な簡略化、低コスト化に成功

 安価に生産された変性状態のタグ付き単鎖抗体を用い、極めて簡便で効率的な単鎖抗体固定化基板の製造プロセスを確立しました。すなわち、タグのポリスチレンに対する親和力を利用して、変性状態の単鎖抗体をポリスチレン製基板上に配向固定化し、さらに基板表面を緩衝液で洗浄することで、基板上に固定化された単鎖抗体の立体構造を正常な状態に回復できることを見出しました。(固相リフォールディング技術)
 (2)、(3)の製造プロセスは、極めて汎用性が高く、多種類の単鎖抗体に利用可能であるとともに、完全長抗体を用いる従来の手法と比較して、抗体固定化基板の製造コストを1/10以下に削減することに成功しました。さらに、タグ付き単鎖抗体の固定化基板を従来の診断用プレートから診断用チップに変更すると、タグ付き抗体の試薬量を大幅に削減可能であり、更なる低コスト化に繋がると期待しています。

(4)高額な分析機器を用いずに、糖鎖プロファイリング診断を実現

 これまでの研究で、多くのバイオマーカーについて、それらの糖鎖構造が疾病時に大きく変化することが明らかとなっており、これを簡便かつ高感度に検出できる技術を開発すれば、臨床診断分野における価値は非常に大きいと考えられます。
 (1)~(3)の要素技術とレクチンの糖鎖認識力を利用し、バイオマーカーの糖鎖構造を評価可能なプロファイリング診断技術を開発しました。すなわち、単鎖抗体固定化基板を用いてバイオマーカーを基板上に選択的かつ高度に濃縮し、バイオマーカーに標識されている糖鎖をレクチンの糖鎖認識能力を利用して高感度に検出することに成功しました。その結果、バイオマーカーに標識された糖鎖構造に基づくシグナルを検出可能となり、バイオマーカーの質的変化を評価できるようになりました。従来の免疫診断ではバイオマーカーの体内濃度が判断基準となる基準値(カットオフ値)を上回るか下回るかで疾病の診断がなされてきましたが、バイオマーカーの体内濃度は年齢、性別、喫煙の有無、妊娠の有無等によって大きく変化するものも多く、必ずしも全ての人に同じ基準値が適応できるわけではありませんでした。本研究で開発された糖鎖プロファイリング診断技術を利用することで、バイオマーカーの量的な変化に加え、質的な変化も新たな診断基準として利用することが可能となり、従来よりも正確な疾病診断が実施できると考えています。
 従来のタンパク質の糖鎖解析は、高純度かつ高濃度の試料を必要とし、さらに、LC-MSやMALDI-TOF MS等の大型で高額な分析機器を要することから臨床診断への応用は困難でした。また、図6に示す通り、従来の完全長抗体固定化基板を用いて糖鎖プロファイリング診断を行った場合、検出感度が低いことに加え、完全長抗体自身の糖鎖も同時に検出されることによる、バックグラウンドシグナルの上昇ならびにS/N比の大幅な低下が問題でした。本研究で開発した単鎖抗体固定化基板は、完全長抗体固定化基板と比較して感度の向上が期待できる点、さらには、単鎖抗体自身が糖鎖を有しておらず、高いS/N比でのシグナル検出が可能です。現在、代表的ながんマーカーをはじめ、様々な疾病マーカーの糖鎖プロファイリング診断システムを開発しており、今後臨床診断への応用が期待されます。

 今回の成果は、日本生物工学会「第35回生物工学奨励賞(照井賞)」の受賞が内定し、10月23日に神戸国際会議場で授賞式および受賞講演を行います。

  • 図6 タグ付き単鎖抗体固定化基板を用いる糖鎖プロファイリング診断システム
    図6 タグ付き単鎖抗体固定化基板を用いる糖鎖プロファイリング診断システム

2.今後の進め方 (予定)

(1)抗体集積化チップの実用化に向けた取り組み

 抗体チップ基板に親和性の高いタグを付加した単鎖抗体の固定化技術をコアとして、タグ付き単鎖抗体の生産、リフォールディング、基板固定化操作を抜本的に見直すとともに、それらを産業利用可能な一連の製造技術として確立することに成功しました。今後、利用できる単鎖抗体/バイオマーカーのレパートリーを可能な限り増やし、臨床診断の低コスト化、高感度化、信頼性の強化に貢献してまいります。また、単鎖抗体集積化チップの検出感度の更なる向上を検討するとともに、血液や尿などの実サンプルを用いた実証試験を進めます。

(2)本成果の他用途への応用展開の取り組み

 本研究で開発した要素技術は、臨床診断のみならず、様々な用途に利用可能であると考えております。例えば、医薬品精製工程におけるアフィニティクロマト担体の開発や食品加工プロセスにおける固定化酵素触媒の高機能化ならびに低コスト化なども本技術が利用可能です。
 また、ポリスチレン基板に親和性の高いタグのみならず、今後、様々な材料表面に高親和的に作用するペプチドタグが単離できる可能性が高く、それらを積極的に利用すれば、タンパク質の高度な機能を有用な材料表面に積極的に付与でき、極めてパフォーマンスの高い次世代のバイオ材料の開発が可能となります。

3.お問い合わせ先

 (本プレスリリースの内容についての問い合わせ先)
  京都工芸繊維大学 大学院工芸科学研究科 生体分子工学専攻
  助教 熊田 陽一
  TEL: 075-724-7542 E-mail: kumada@chem.kit.ac.jp

 (産業技術研究助成事業(若手研究グラント)についての問い合わせ先)
  NEDO 技術開発推進部 担当:田畑、井澤
  TEL: 044-520-5174

 (その他NEDO事業についての一般的な問い合わせ先)
  NEDO 広報室 担当:遠藤
  TEL: 044-520-5151  E-mail:nedo_press@ml.nedo.go.jp 

 (産学官連携会議/イノベーションジャパンの開催概要について)
  日時: 2012年9月27日(木) 9:30~17:30
              9月28日(金)10:00~17:00
  会場: 東京国際フォーラム(東京都千代田区丸の内3丁目5番1号)
  主催: 独立行政法人科学技術振興機構(JST)
  独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)
  共催: 文部科学省、経済産業省、内閣府
  入場料: 無料
   URL:http://www.innovation-japan.jp/

【用語解説】

(※1)免疫診断:
抗体の抗原に対する特異的親和性を利用した診断技術。他の診断技術と比較して検出感度はpg~ng/mlと比較的高いが、マウスやヤギ等、哺乳動物の体内から精製された抗体を利用して行われるため、製造および診断コストが高く、また、倫理的問題も大きい。
(※2)単鎖抗体:
遺伝子組換え技術によって設計された低分子量の抗体である。通常の抗体と比較して1/5~1/6の分子サイズであり、大腸菌や酵母等、微生物を用いて大量生産が可能である。大腸菌によって単鎖抗体を生産した場合、そのほとんどは不溶で不活性な凝集体(インクルージョンボディ)として回収されるため、立体構造を正しく巻き戻す操作(リフォールディング操作)が必要となる。
(※3)バイオマーカー:
血液や尿など、体液中に存在する生体分子であって、特定の疾病の発症や進行にともなって体内濃度が変化するものをバイオマーカーと呼ぶ。バイオマーカーの体内濃度を定量することで、重篤な疾病の早期発見に繋がる。
(※4)リフォールディング:
大腸菌で単鎖抗体等の異種タンパク質を大量生産した場合、大部分は正しい立体構造を持たない不溶で不活性な凝集体(インクルージョンボディ)として回収される。インクルージョンボディ内の目的タンパク質を尿素等のタンパク質変性剤で可溶化し、正しい立体構造に巻き戻す操作をリフォールディングと呼ぶ。
(※5)糖鎖プロファイリング診断:
バイオマーカーの糖鎖の特異な構造をレクチンの糖鎖結合能を利用して検出することが可能。多種類のレクチンを利用することで様々な糖鎖構造を検出可能であり、これらを組み合わせることでバイオマーカーに標識されている糖鎖の構造をプロファイリングできる。
(※6)ペプチドタグ:
単鎖抗体を材料基板上に均一な配向で固定化するために、材料表面に対して付着可能な特定のペプチド配列を単鎖抗体の片方の末端に導入し、これをペプチドタグと呼ぶ。ペプチドタグの導入によって単鎖抗体を高密度かつ均一な配向で固定化できるようになる他、固定化後の単鎖抗体の安定性も向上する。