成果報告書詳細
管理番号100013577
タイトル平成17年度-平成19年度成果報告書 国際共同研究助成事業 2005IS144 創薬・診断において重要な薬物トランスポーター遺伝子多型の機能解析技術の国際標準化 平成19年度最終
公開日2009/4/24
報告書年度2005 - 2007
委託先名石川智久 Kathleen M. GIACOMINI Balazs SARKADI 中川大 松田洋一 大隅正子
プロジェクト番号P88001
部署名研究開発推進部
和文要約近年、ヒトゲノム解析プロジェクトが終了し個の医療の実現に向けた取り組みが世界規模で進んでいる。薬の効果および副作用には、薬剤ターゲットのタンパク質の他、薬物代謝酵素や薬物トランスポーターにおける遺伝子多型が重要な因子である。そのようなパラダイム・シフトに鑑みて、多様な薬剤の吸収や分布、および抗癌剤に対する多剤耐性に大きく関与するABCトランスポーターの一塩基多型に研究の焦点を絞り、SNPの機能解析方法を確立し国際標準化に導く。2007年度、石川らは遺伝子多型をもつ薬物トランスポーターを発現させて機能解析を行うために、哺乳類細胞系としてFlp-In-293細胞の妥当性を検討してきた。そのヒト胎児腎臓由来の培養細胞のゲノムDNA中に挿入されたpFRT/lacZeoベクターの位置を解析するため、まずDNAWalkingSpeedUpPremixKitによる解析を行った。さらにpFRT/lacZeoベクターの5'および3'両端からFlp-In-293細胞ゲノムDNAの方向へ向かうプライマーと、キットに付属するDNAWalking-AnnealingControlPrimerを用いPCR反応を行った。得られた約700bpのPCR産物の塩基配列を解析した。さらにFlp-In-293/ABCG2細胞を用いて、MG132処理によって細胞の微細構造、特にタンパク凝集体にABCG2タンパク質が局在することを免疫電子顕微鏡法で確認した。細胞内小器官に特異的な蛋白質に対する抗体で免疫蛍光染色を行い、SNPによるトランスポーターの細胞内局在部位の影響を確認した。ABCG2はポルフィリン輸送に関わることを発見し、遺伝子多型および薬物による阻害で細胞の光線過敏が引き起こされることを実験的に証明した。Sarkadi等はABCG2に焦点を絞って、Sf9昆虫細胞系を用いた機能解析方法の樹立を目指した。彼らは膜ベシクルにコレステロールを加えるとABCG2の輸送活性が顕著に向上することを発見し、高速スクリーニングシステムを構築した。一方Giacominiらは、ルシフェラーゼ・プロモーターアッセイ方法を樹立し、核酸トランスポーターおよび有機アニオントランスポーターの遺伝子発現調節メカニズムを解明した。石川は米国AstraZeneca社研究所で薬物トランスポーターの高速機能解析技術に関して講演を行い、薬物トランスポーターの高速機能解析技術を企業へ技術移転することが決定した。また、武田薬品工業にも昆虫細胞発現系を構築する技術の移転と人材養成をすることが決まり契約を準備した。一方Sarkadiが開発した技術はハンガリーのベンチャー企業SOLVO社に技術移転された。ファーマコゲノミクスは個の医療を実現するにあたって重要な研究である。その中でも本研究は、薬物トランスポーターのファーマコゲノミクスというユニークさを持つ。本プロジェクトで同定された臨床上重要なSNPを検査するために、臨床現場で使用可能な世界最速SNP診断装置を開発した。国際標準化プロジェクトの究極ゴールとして、2008年10月2-3日に、石川とGiacominiは米国BethesdaでFDACriticalPathTransporterWorkshopを開催し、製薬企業とともに薬物トランスポーター機能解析技術の標準化と臨床への応用に関して講演とガイドライン作成の話し合いを行った。その結果2009年1月までWhitepaperをまとめることが決定し、それを公表するジャーナルの選定を行った。
英文要約Evidence is accumulating to strongly suggest that drug transporters are major determinants of pharmacokinetics and drug response. There are two major superfamilies of drug transporters: solute carriers and ATP-binding cassette transporters. Single nucleotide polymorphisms of drug transporters have been documented to play a significant role in the patients' responses to medication. To clarify the actual impact of genetic polymorphisms on function and/or protein expression of drug transporters, we need to establish reasonable in-vitro validation systems. Ishikawa et al. examined the potential link between nonsynonymous SNP and the stability of ABCG2 protein. Direct evidence was provided to show that nonsynonymous SNP variants undergo ubiquitin-mediated protein degradation in proteasomes. It is likely that misfolded ABCG2 proteins are removed from the ER by retrotranslocation to the cytosol compartment and degradation by the ubiquitin-proteasome system. The ABCG2 aggresomes have most recently been observed by immuno-electronmicroscopy technology in the laboratory of Osumi et al. Functional impairment owing to inhibition of ABCG2 by drugs or its genetic polymorphisms lead to the disruption of porphyrin homeostasis. Ishikawa et al. have developed in vitro assay methods for the inhibition of porphyrin transport and cell-based photosensitivity. Such technologies may offer a great advantage for predicting photosensitive reactions before drugs are introduced in therapy or products made available on the market. Sarkadi et al. continued to investigate the mechanism of action of the ABC multidrug transporters, focusing on the ABCG2 protein. New methods were established for the assessment of the specific transport and ATPase activity of the human ABCG2 multidrug transporter, expressed in Sf9 cells. By loading the membranes with excess cholesterol, this assay is now fully applicable for high capacity and high throughput drug testing. They also developed new technologies related to the cell surface detection of human ABCG2 by a conformation-sensitive monoclonal antibody. Furthermore, they generated a new tool for drug discovery, the GFP-conjugated ABCG2 protein, which can be used for a simultaneous detection of the localization and function of this transporter. The method enables us to analyze the expression and function of the ABCG2 protein in human embryonic stem cells, and the down-regulation of the ABCG2 expression during stem cell differentiation. The results of these studies are already applied by SOLVO biotechnology in their assay kit systems. Giacomini et al. have continued to establish assays for membrane transporters including reporter assays for analysis of the effect of promoter region variants on transporter expression. Some of their studies include luciferase promoter assays for nucleoside and organic ion transporters and their genetic variants.
ダウンロード成果報告書データベース(ユーザ登録必須)から、ダウンロードしてください。

▲トップに戻る