成果報告書詳細
管理番号100013616
タイトル平成17年度-平成19年度成果報告書 平成17年度第2回採択産業技術研究助成事業 05A02509a 低侵襲的生体分子イメージングに向けた生物発光プローブの開発 平成19年度最終
公開日2009/4/24
報告書年度2005 - 2007
委託先名国立大学法人東京大学小澤岳昌
プロジェクト番号P00041
部署名研究開発推進部
和文要約(1)ペプチド切断酵素(Caspase)の活性化プローブの開発Caspase-3検出プローブをコードする遺伝子を、アデノウィルス産生ベクターに移し替え、培養細胞に遺伝子導入した。培地に産出したアデノウィルスを回収し、その基礎評価を行った。マウス肝臓由来培養細胞にアデノウィルスを感染させ、caspase-3活性を上昇させるスタウロスポリン(STS)を添加すると、バックグラウンド発光に対し、5倍以上の発光を示すことがわかった。マウス肝臓の内在性Caspase-3活性を非侵襲的に可視化するための、アデノウィルスの作製に成功した。(2)タンパク質(Bad)のリン酸化検出プローブの開発luciferaseのN末ドメインとC末ドメインに、Badと14-3-3あるいはBcl-2を連結し、Badのリン酸化状態を発光検出するプローブを開発した。プローブは培養細胞に一過的に発現させ、マウス個体内に培養細胞を移植してBadリン酸化の評価を行った。細胞の移植量をモニターするために、鉄道虫由来の赤色ルシフェラーゼを、プローブ発現培養細胞に同様に一過的に発現させた。その結果、マウスの四肢付け根に移植した細胞から、Badのリン酸化に伴う発光を低侵襲的にイメージングできることがわかった。マウス個体内においてBadのリン酸化を非侵襲的に可視化する技術の確立に成功した。(3)RNAの細胞内発現検出プローブの開発サイトゾルに局在することが明かになっているβアクチンのmRNAをターゲットとして、プローブをデザインし開発した。プローブをCOS-7細胞およびHeLa細胞に発現させ、蛍光顕微鏡を用いてその局在を観察した。その結果、チューブリン上に局在するβアクチンmRNAが可視化できることを実証した。本結果から、生きた単一生細胞内において、サイトゾルに局在するβアクチンmRNAを可視化する新たなプローブの開発に成功した。
英文要約(1) We developed adeno virus encoding caspase-3 probe for in vivo monitoring of caspase-3 in living mice by using the luciferase reconstitution technology. The adeno virus was injected from tail vein of mice and the probe was expressed in their liver. We showed that the luminescence of the probe increased 5-times higher than the background luminescence upon caspase-3 activation. (2) The Bad probe was found useful for cell-based screening in a high-throughput manner. To demonstrate the applicability of the probes, the probe was expressed with a cDNA of railroad warm luciferase as its internal control. The cells were implanted on the back of mice and monitored the phosphorylation of Bad in living mice. We showed that the cells could be used for monitoring the extent of Bad phosphorylation noninvasively. These probes provide general means for screening novel pharmacological chemicals among candidates. (3) Fluorescent RNA probes for beta-actin were developed for monitoring localization in living cells. The probes were designed to be specifically recognized a 16-base sequence of beta-actin mRNA, which allowed specific localization of mRNA in single living cells.
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