成果報告書詳細
管理番号20090000000320
タイトル*平成20年度中間年報 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術開発) セルロース系バイオマス酵素糖化の高効率化をめざした新規セルラーゼの取得と大量生産技術の研究開発
公開日2009/8/28
報告書年度2008 - 2008
委託先名国立大学法人東京大学大学院農学生命科学研究科 新日本石油株式会社 長瀬産業株式会社 秋田県農林水産技術センター
プロジェクト番号P07015
部署名新エネルギー技術開発部 バイオマスグループ
和文要約以下本編抜粋:1.研究開発の概要 セルロース系バイオマスのエタノールへの変換は、前処理、糖化、発酵、精製の4つの段階によって構成されているが、糖化工程については生成物の選択性および収率の高さ、低環境負荷などの理由から酵素糖化法の採用が強く望まれている。しかしながら、現時点では前処理後のバイオマスを糖化するために多大な量の酵素(セルラーゼ)を反応系に添加することが必要であり、このことによる変換コストの著しい増大を引き起こすことが酵素糖化法の導入に向けて解決すべき大きな課題となっている。本研究開発では、この問題を解決するために申請者らがすでに学術誌で提案している「セルラーゼの吸着密度に基づく反応速度理論」(K. Igarashi et al., 2006)及び、この理論に基づいたセルラーゼによる種々のセルロース基質の反応特性解析(K. Igarashi et al., 2007)の結果を適用して、天然セルロースのI型結晶型をIII型結晶型に改変したセルロース基質に対して反応性が著しく高いセルラーゼの選抜を行う。また、選抜されたセルラーゼに対応するcDNA を取得し、これをピキア酵母の発現系を利用して大量生産する技術を開発する。さらに、このようにして得られた組換え体セルラーゼを用いて、適切な前処理を施した各種セルロース系バイオマスに対する酵素糖化実験ならびにエタノール発酵試験を行い、その結果から選抜した酵素の性能評価を行う。
英文要約“Purpose of the Project” In order to introduce enzymatic saccharification into the production of ethanol biofuel from cellulosic biomasses, enzymatic activity on crystalline celluloses must improve dramatically so as to reduce the dosage of cellulase. The aim of this project is to obtain highly active enzymes for saccharification of crystalline cellulose IIII, which is converted from native crystalline cellulose I by supercritical ammonia treatment. The goal is to achieve 40 times higher efficiency on enzymatic saccarification for crystalline cellulose IIII with selected enzymes than that for native crystalline cellulose I with Cel7A (cellobiohydrolase I) from Trichoderma reesei. The cDNA of selected enzymes will be cloned and overexpressed in Pichia yeast. The activity of the recombinant enzymes for the saccharification of crystalline celluloses and ethanol fermentation will be evaluated. “Summary of the Results” (1) Screening of Novel Cellulases and Cloning of cDNA (The University of Tokyo): The cDNA encoding Cel6A from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium was cloned and expressed in Pichia yeast. The decrease in the hydrolytic activity of Cel6A for crystalline cellulose was less affected even under the higher density of enzymes adsorption on the surface of crystalline cellulose. The total hydrolytic activity of the Cel6A on crystalline cellulose IIII was 38 times higher than that of T. reesei Cel7A for native crystalline cellulose I. In FY2008, the cDNA encoding Cel45A from the P. chrysosporium was cloned and expressed in Pichia yeast. By the combination of Cel6A and Cel45A, the total hydrolytic activity on crystalline cellulose IIII was 52 times higher than that of T. reesei Cel7A on native crystalline cellulose I. Consequently, the purpose of this project was achieved. (2) Large-scale Production of Recombinant Enzymes using the Expression System of Pichia yeast (Nagase & Co., Ltd.): The culture conditions for over expression of the recombinant enzyme Cel6A, which was cloned by the University of Tokyo and introduced into the alcohol oxidase l promoter (AOX1) were optimized. In the fed-batch fermentor, the level of extracellular proteins reached 4.6 g/L at 120 h of incubation after methanol addition. In FY2008, constitutive overexpression of Cel6A with the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter (GAP) was examined. In the fed-batch fermentor, after 72 h of incubation, the level of extracellular proteins reached 1.2 g/L. Moreover, 1.1 g/L proteins production was achieved by using 20 % glucose solution as a substrate. (3) Saccharification of Various Biomass using Recombinant Enzymes (Nippon Oil Corporation): In FY2007, to optimize the conditions of ammonia treatment for preparation of several biomass samples, the crystalline structure of cellulose converted to cellulose IIII. In FY2008, the saccharification of sugarcane bagasse converted to cellulose IIII by using the recombinant enzyme Cel6A or the mixture of Cel6A and T. reesei Cel7A was determined. The total hydrolytic activity of Cel6A by itself on the sugarcane bagasse IIII was less than that of Cel7A, but the activity of their mixture showed a significant synergy effect each other. Consequently, Cel6A was highly effective for saccharification of the biomass.
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