成果報告書詳細
管理番号20090000000321
タイトル平成19年度-平成20年度成果報告書 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術開発) 遺伝子組み換えE.coli及びC.glabrataの共培養によるアルコール生産に関する研究
公開日2009/8/28
報告書年度2007 - 2008
委託先名株式会社Biomaterial in Tokyo 国立大学法人宮崎大学 国立大学法人千葉大学
プロジェクト番号
部署名新エネルギー技術開発部 バイオマスグループ
和文要約バイオマス糖化模擬糖液(グルコース6.7%(w/v):キシロース3.3%(w/v))を原料としてエタノール生産を行うため、 1、遺伝子組換え技術を用いて、五炭糖のみからエタノールを生産する大腸菌株を作製する。対キシロース重量に対するエタノール収率目標:90% (宮崎大学担当) 2、上記模擬液を上記遺伝子組み換え大腸菌にて使用したあとの液(グルコース濃度6.7%(w/v)程度残存)を使い、C. glabrataにてエタノール生産を行う。対グルコース重量に対するエタノール収率目標:80%(千葉大学担当) 3、上記1及び2より得られた組み換え大腸菌およびC. glabrataを共培養する。対糖総エタノール収率目標:85%(Biomaterial in Tokyo 担当)を目標に研究開発を実施した。 この結果、1、遺伝子組み換え大腸菌であるKO11を親株として、ptsG遺伝子破壊株を新たに作製した。この株をKO11△Pと名づけ、グルコースの取り込みが緩やかになり、キシロースの消費速度が親株KO11の約3.5倍に増加することを確認した。エタノール生産試験により、KO11△P株は1段目の発酵でエタノール濃度が4.4%に達する事が確認され、対糖収率で約92%程度を達成した。初発のキシロース濃度4.0%が、発酵8日目には0.4%にまで低下した。消費されたキシロースはエタノールに変換されているので、キシロースからのエタノール収率は90%となり、目標値90%を達成。(特許出願済:出願番号 特願2009-029041号)2、C. glabrataについて、エタノール生産能を確認したところ、エタノール発酵で一般的に使用しているパン酵母S. cerevisiaeに比べて同程度であり、さらに、より低pH、高塩濃度条件下ではパン酵母より多くのエタノールを生産することが確認された。C. glabrataは低pH、高塩濃度の悪条件下でもエタノールを生産できることが判明。更に、プロモーターの強化などによる育種により、グルコースに対するエタノール収率は90%台が得られ、目標値80%を達成した。(特許出願済:出願番号 特願2008-333082号)3、当初、KO11 → C. glabrataの順での共培養によるエタノール発酵を計画していた。ところが、一般に五炭糖、六炭糖ともに代謝可能な微生物は、グルコースを先に消費してからキシロースを食べるといった「ダイオキシー」現象が知られており、KO11にも同様の現象が見られた。このため、五炭糖の発酵開始時間が大幅に遅れることが問題になり、この対応策として発酵順を変え、C. glabrata → KO11の順で連続発酵した。またこの改良プロセスではKO11発酵槽がC .glabrataとの共培養発酵になっている。対糖総エタノール収率は80%であった。更に総エタノール収率の向上を目指し、ダイオキシーを解除したKO11△PとC. glabrataとの共培養発酵では、対糖総エタノール収率94%が得られた。目標値85%を9%上回る好結果であった。 また、バイオマスの糖化液(実液)での発酵性の検討では、稲ワラのアルカリ蒸解酵素処理による糖化液を作製し、KO11△PとC. glabrataで共培養発酵し、単糖に対するエタノール収率95%以上が得られた。工業規模で入手できる実液として、日本製紙ケミカル(株)江津事業所より入手したサルファイトパルプ製造時の黒液を使用し、発酵阻害物質を除去することにより、対糖エタノール収率72%が得られた。 今後、更なるエタノール収率の向上、効率化等の研究を継続したい。
英文要約Aim of this project is to establish a core technology for efficient ethanol production from cellulose-based biomass. Specifically, we focused on simultaneous ethanol fermentation from hexoses and pentoses, using recombinant E. coli (for pentoses) and C. glabrata (for hexoses). Recombinant E. coli strains, which were tailored to ferment ethanol from pentoses (ie. xylose) specifically, were constructed. The simulated carbohydrate solution containing 6.7% glucose and 3.3% xylose was fermented by them first. The goal of the ethanol yield from xylose was more than 90%. (done at Miyazaki University) The remaining hexoses (glucose) in the E.coli-fermented simulated carbohydrate solution, was fermented further in the second step by C. glabrata (wild type or improved recombinant strains). The goal of the ethanol yield from glucose was more than 80% (done at Chiba University) The recombinant E. coli and C. glabrata strains were co-cultured to achieve simultaneous hexose/pentose fermentation. The goal of total ethanol yield from the sugars was more than 85%. (done at Biomaterial in Tokyo) The original E. coli strain in this work was E. coli KO11 strain, which is capable of efficient ethanol fermentation from xylose/glucose. To make the strain more specialized to pentose fermentation, ptsG gene, which involves with glucose intake, was disrupted by recombination (Red-recombination system). The resulting strain, KO11ΔP had significantly reduced glucose consumption rate, but increased xylose consumption rate (about 3.5-fold higher than KO11). Fermentation by this strain in a media containing 6% glucose and 4% xylose resulted in 4.4% ethanol production and yield of total sugar was about 92%. Initial xylose concentration was 4% and decreased to 0.4% after 8 days. Because consumed xylose was converted to ethanol, the ethanol yield from xylose was 90%, achieving our goal (90%). (Already a patent application: application No. 2009-029041 ) Ethanol fermentation performance of C. glabrata was compared with that of S. cerevisiae, the gold standard yeast for ethanol fermentation all over the world. We found that C. glabrata CBS138, the wild type strain, had decent ethanol fermentation capability (85-90% conversion rate from glucose). At the same time, we found C. glabrata performed better under stressed conditions (low pH, high temperature, and high salt concentration) than S. cerevisiae. Ethanol production by C. glabrata was further improved by over-expressing or disrupting certain genes by recombination (90-95%). As a result, our initial goal was achieved (80%). (Already a patent application: application No. 2008-333082) Our initial experimental plan was E. coli KO11 fermentation first, and then co-culture with C. glabrata, converting pentoses and hexoses simultaneously to ethanol. However, this scheme was hampered by a phenomenon called “diauxie” (a French word meaning double growth). When E. coli is exposed to a medium containing pentose (xylose) and hexoses (glucose), it utilizes glucose first, then after glucose deprivation, xylose. This makes xylose fermentation in the first step extremely slow. To solve this problem, we changed orders of fermentation from “E. coli KO11-> C. glabrata” to “C. glabrata -> E. coli KO11”. In the modified scheme, second step was actually co-culture of C. glabrata and E. coli (Fig.13.). In this setup, 80% ethanol yield of total sugar was achieved. To improve ethanol production further, the diauxie-free E. coli KO11ΔP strain was used, instead of the parental KO11 strain, resulting in 94% ethanol yield from the total sugar. This means that the number outperforms our initial goal (85%) by 9%, which is quite significant improvement.
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