成果報告書詳細
管理番号20090000000137
タイトル平成18年度-平成20年度成果報告書 「健康安心イノベーションプログラム/糖鎖機能活用技術開発/糖鎖認識プローブの作成技術の開発」
公開日2009/12/9
報告書年度2006 - 2008
委託先名国立大学法人北海道大学
プロジェクト番号P06010
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部 健康グループ
和文要約コンドロイチン硫酸(CS)を含むグリコサミノグリカンは、動物細胞の細胞表面や細胞外マトリックスに普遍的に存在する多糖で、細胞の移動、増殖、分化などの過程において、様々なタンパク質因子と相互作用し、それらの生理活性を調節することによって機能を発揮することが知られている。高硫酸化CSが癌のマーカーとして利用できると予想されたので、そのような構造を認識する抗体の作製を目指した。
1) ファージディプレイ抗体GD3G7の性質の研究
実施者らは、高硫酸化CSであるCS-Eを特異的に認識するファージディスプレイ抗体GD3G7を、ファージライブラリーから選別することに成功した。この抗体の詳細な特異性を種々の硫酸化グリコサミノグリカンを用いて評価し、本抗体が実際にE-unit と呼ばれるGlcA-GalNAc(4,6-O-ジ硫酸)という二糖構造を含むCS-Eを強く認識し、他のCS異性体とは反応しないことを明らかにした。この抗体の認識するエピトープ構造がヒトの正常な卵巣では発現せず、卵巣癌組織で高発現していることも見いだした。
CS-Eと癌との関わりが示唆されたので、転移能の異なるマウス癌細胞の組み合わせを用いて、GD3G7抗体との反応性を調べたところ、高い転移能を示す癌細胞の方との反応性が有意に高いことが分かった。高転移性の癌細胞のCS鎖では低転移性のものに比べてE-unitの割合が高かった。in vitroにおいてGD3G7が培養癌細胞株の接着および浸潤を有意に阻害し、in vivoにおいても、CS-Eの添加およびGD3G7抗体の添加による強力な癌転移抑制効果を見いだした。ティシューマイクロアレイを利用して、ヒト癌組織に対するGD3G7の特異性も広く調査した。その結果、正常組織では殆ど染色は見られなかったが、癌組織では強い染色が見られた。
2)マウス抗CS抗体WF6の性質の研究
サメ胎児軟骨のCSプロテオグリカンに対するマウス単クローン抗体WF6を作製した。WF6を用いて様々な疾患の患者の血清中のエピトープ濃度を調べ、卵巣癌患者の血清中で異常に高いことを明らかにした。
そのエピトープの構造を明らかにすべく、サメ軟骨由来のCS-Cを市販の分解酵素で限定消化して調製したオリゴ糖画分との反応性を調べた。最も強く反応した画分は他と明瞭に異なる八糖配列を含んでいた。しかし、一次配列上の際立った特徴は見いだされなかった。そこで、この理由を解明するために、サメ軟骨から単離した4種類の八糖配列について、三次元構造と静電ポテンシャルの表面分布を計算科学で求め、比較した。WF6と結合する2種類の八糖配列の間には、分子形態と静電ポテンシャルに著しい類似点があるが、結合しない八糖とは非常に異なっていた。
3)海産動物由来のCSに対するマウス特異抗体の作製
イカ軟骨よりCS標品を精製した。これを免疫原としてマウスを免疫した。作製した抗体に関して、様々なCSオリゴ糖に対する反応性を調べ、幾つかの抗体がCS鎖とコアタンパク質との結合領域部分の特殊な構造を認識することを見いだした。さらに、これらの抗体の癌組織に対する反応特異性を明らかにするため、ティシューマイクロアレイを利用して染色実験を行った。その結果、癌組織での染色も幾分見られたが、正常組織でも強く染色される場合があり、今のところ癌に特異的な染色パターンを観察してはいない。
英文要約Glycosaminoglycans (GAGs) including chondroitin sulfate (CS) are sulfated linear polysaccharide chains, which are found in the extracellular matrices or at cell surfaces. GAGs are implicated in many biological processes. The objective of this study was to generate and characterize antibodies recognizing highly sulfated CS structures, which would be useful tools in the diagnosis and treatment of malignant tumors.
(1) Characterization of a phage display antibody GD3G7.
A phage display antibody GD3G7 was screened based on its specific reactivity toward highly sulfated CS chains. We found that this antibody specifically reacted with CS-E from squid cartilage (rich in the GlcUA-GalNAc(4,6-O-sulfate); disaccharide unit E). We have also reported that the epitope structures are strongly expressed in ovarian adenocarcinomas, but not in normal ovary or cystadenomas.
Since the involvement of highly sulfated structures of CS chains in the metastatic processes has been implicated, we examined the expression of E-unit-containing epitopes in the cell lines with different metastatic potentials. Highly metastatic cells rather than low metastatic cells expressed more strongly the CS-E epitope. A structural analysis of CS revealed a higher proportion of E-units in the highly metastatic cells than in the low metastatic cells. The metastasis was effectively inhibited by CS-E and GD3G7 in a dose-dependent manner. We also investigated the reactivity of GD3G7 toward various tumors using human tissue microarray. At least certain tumor tissues were strongly recognized by GD3G7 whereas no staining was observed in normal tissues.
(2) Characterization of an anti-CS mouse monoclonal antibody WF6
A mouse monoclonal antibody WF6 was raised against shark embryonic CS-proteoglycans. Sensitive analysis of the serum CS epitope of WF6 in patients with ovarian cancer and with non-cancer gynecological disorders showed that the serum concentration was highly increased in ovarian cancer.
To elucidate the structure of the epitope of WF6, we characterized four structurally defined oligosaccharide fractions for binding to WF6. The structure and sequences of both the binding and nonbinding octasaccharides were compared by computer modeling, which revealed a remarkable similarity of the molecular shape and the distribution of the electrostatic potential in the two distinct octasaccharide sequences recognizable by WF6.
(3) Preparation of a mouse monoclonal antibody against highly sulfated CS from marine animals.
The binding specificity of the antibodies raised against the purified squid cartilage CS was investigated. Some of them recognized a specific saccharide sequence present at the CS-core protein linkage region. Their reactivity toward various tumors was also investigated. Some tumor tissues were strongly recognized but normal tissues were also immunostained, suggesting that the epitope structures are not specifically expressed in tumor tissues.
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