成果報告書詳細
管理番号20100000001602
タイトル平成19年度-平成21年度成果報告書 固体高分子形燃料電池実用化戦略的技術開発 次世代技術開発 マルチ銅酵素を基軸とする新規カソード触媒の研究開発
公開日2010/9/30
報告書年度2007 - 2009
委託先名国立大学法人京都大学
プロジェクト番号P05011
部署名燃料電池・水素技術開発部
和文要約電気化学的な酸素の完全4電子還元反応の触媒として、マルチ銅オキシダーゼ(MCO)に注目し、その基礎ならびに応用の研究開発を行った。MCOは分子内にブルー銅と呼ばれるタイプI (T1) Cuと、非ブルー銅であるタイプII (T2) Cuと2つのタイプIII (T3)銅を有し、酸素を電子受容体として、さまざまな物質を酸化する。MCOは溶液中ではT1で基質から電子を受取、T2/3クラスターで酸素を4電子還元し、H2O2等の酸素の還元中間体は遊離しない。この点が無機触媒との大きな差異のひとつである。自然界には、非常に多くの種類のMCOが存在し、その一部は現在産業用酵素として重要な位置を占めている。本研究開発成果を計画に沿った6項目で以下にその概要を説明する。 i) 新規MCOの探索と基本特性評価に関しては、まず高い活性ならびに耐性を有するMCOとして選抜していた由来のlaccase Iの遺伝子配列を解明した。本酵素は、約0.2 Vという非常に小さい過電圧で、酸素の拡散律速還元を実現することが分かった。しかし、弱酸性でのみ機能する弱点もある。Bilirubin oxidase (BOD)は中性でも電極触媒として利用できる利点がある。一方、電極触媒活性という面では、copper efflux oxidase (CueO)が非常に有望であり、電極反応の解析には都合が良いことがわかった。 ii) 酵素構造解析においては、BODの結晶化ならびにその結晶構造解析に初めて成功した。また、CueOの5番目から7番目のα-helixをタンパク質工学的に削除(Δα5-7)することにより、活性を高めることに成功した。またその結晶化および精密な構造解析も行い、Δα5-7処理による構造変化はほとんどないことを示し、タンパク質工学的アプローチの有用性を示した。MCOが電極触媒として機能する場合も、T1が電子の受け取りサイトであることを明らかにした。したがって、酸素還元過電圧を減少させるためには、T1Cuの電位が正であるMCOを探索、あるいは創成することが重要である。天然MCOのT1Cuの酸化還元電位とその軸配位子関係を調べたところ、電位はおおよそPhe (例えばTrametes sp. Ha-1由来のlaccase I) > Leu - Met (例えば、BOD, CueO) > Glnの順になることがわかった。またT1サイト周辺の水素結合の形成または切断によって酸化還元電位を調整できることも示し、一般性の高い原理として、非常に重要な知見を得た。 iii) Δα5-7CueOの部位特異的変異体をいくつか調整し、酸素4電子還元反応の中間体IとIIの捕捉に成功した。その結果、T2/3クラスターの配位子の外側に位置するAsp112とGlu506 (as CueO numbering)がそれぞれ、酸素結合とプロトン供給に関与することを明らかにした。これらの事実および中間体の構造解析結果を基に、酸素4電子反応の新しいミカニズムを提唱した。 iv) MCOの界面電子移動は、T1サイトへの基質のとりこまれやすさとは無関係であり、電極-T1間は、長距離電子移動特性を有していることがわかった。また、電極表面の官能基としてCOOH末端を有する状態が電子移動に適していた。一方、吸着酵素は電気二重層内の電場との相互作用により部分変性をすることを初めて明らかにした。この負の効果は電極への単分子皮膜により回避できることを示した。 v) カーボンクライオゲルの平均メソ孔半径を、数nm-数十nmの範囲で任意に変化させる新しい調整法を考案した。またメソ孔半径が酵素吸着量を決める重要な因子であることを明らかにした。 vi) テフロンをバインダーとしてKetjen Blackを炭素素材として多孔性電極を作成し、CueOを吸着させた空気拡散型電池を作成し、酵素触媒酸素還元反応としては世界最高レベルの20 mA cm-2強の電流密度(passive mode)を実現した。この電極は少なくとも20 hの連続運転ができた。
英文要約Multi-copper oxidases (MCOs) are a family of enzymes that have one blue copper ion at type I site (T1), one non-blue copper ion at type II (T2), and two non-blue copper ions at type III (T3). MCO catalyzes 4-electron reduction of dioxygen (O2) to water with various electron donors without release of reaction intermediate(s) of reduced oxygen species such as H2O2. There are varieties of species of MCOs and some of the enzymes have been utilized on industrial bases. The result of this project will be summarized in view of 6 categories proposed in the original plan. i) Laccase I from Trametes sp. Ha-1 has been cloned. The enzyme can work as a good catalyst for electrochemical oxygen reduction in diffusion-controlled level with an overpotential as low as 0.2 V, although the optimum pH region is limited in weakly acidic conditions. Bilirubin oxidase (BOD) can work even in neutral pH. Copper efflux oxidase (CueO) shows extremely high catalytic acidity for electrochemical O2 reduction, though the overpotential is somewhat large. ii) Crystallographic structural analysis has successfully been performed for BOD and Δα5-7CueO which is protein-engineered to delete α helixes numbed with 5-7. The Δα5-7CueO mutant shows very high catalytic activity in solution with minimum structural change, which reveals the effectiveness of the protein engineering approach. The T1 site works as electron accepting one even in the function as electrode catalysis. This means that the important point is to screen or protein-engineeringly generate MCO with high redox potential. The amino acid located in the axis site of T1 is found to govern the T1 redox potential: Phe is the most effective amino acid. Leu, His, and Gln are followed in this order. The T1 redox potential is also influenced by the hydrogen bonding of amino acids which locate near the T1 site but are not directly coordinated to the T1 site. iii) Several mutants of Δα5-7CueO were expressed and intermediates I and II in the catalytic cycle have successfully been trapped by using some of the mutants. The result indicates that Asp 112 and Glu506 (as CueO numbering) work as O2 binding and proton donation, respectively. Considering these results, a new mechanism of the enzymatic oxygen reduction has been proposed. iv) The electron transfer from electrode to the T1 site is very different from that from substrate to T1, and shows a long range electron transfer property. The COOH function on electrode surface seems to be convenient for the electron transfer from the electrode to the enzyme. The enzyme in the electric double layer is found to be labile to be subjected to denaturation due to the strong electrostatic interaction in the electric field. However, the negative effect is successfully overcome by modifying electrode with small molecules at single molecular level. v) Carbon cryogels with mesoporous in the range from few nm to few ten nm in raidus have been successfully prepared. It has been found that the radius is very important factor to control the amount of the adsorbed enzyme and then the catalytic current density. vi) An air-breath type cathode has successfully been prepared. Teflon is found to be most suitable as a binder. The maximum current density of above 20 mA cm-2 in a passive mode has been realized for the first time in the world and the bio-cathode has continuously been working for at least 20 h.
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