成果報告書詳細
管理番号20100000001799
タイトル平成19年度-平成21年度成果報告書 「微生物群のデザイン化による高効率型環境バイオ処理技術開発/厨房廃水処理用油脂分解バイオフイルムの高機能化・安定化のための微生物製剤導入技術の研究開発事業」
公開日2010/11/10
報告書年度2007 - 2009
委託先名国立大学法人名古屋工業大学
プロジェクト番号P07024
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約本研究では、グリーストラップ内で油を分解処理するための厨房廃水処理用油脂分解バイオフィルムの高機能化・安定化のための微生物製剤とその導入技術の開発を目指し、下記の成果を得た。
グリーストラップ内の環境は、油脂の加水分解のためpHが6.0以下の弱酸性であるため、pH 6.0において増殖可能である油脂分解微生物をスクリーニングし、共生関係にある新規の微生物を2株得ることに成功した。種々の炭素源を用いた資化試験およびrDNA配列による系統樹解析の結果、一方はリパーゼを分泌して油脂を加水分解後脂肪酸を資化する細菌Burkholderia arboris SL1B1、もう一方はリパーゼ分泌能力は極めて低いがグリセロールを優先的に資化する酵母Candida cylindracea SL1B2であると同定した。これら微生物を動物実験に供し、非病原性であることを確認した。
pH 6.0に制御した状態でのバッチ培養における微生物の増殖と油の除去過程、リパーゼ活性を調べた結果、SL1B1株単独でも、論文や特許等で公表されている油脂の分解能力が極めて高い微生物と同等レベル以上の速度で油分の除去(脂肪酸の消費速度で評価)が可能であった。しかも既報は全てpH7.0の条件での分解結果であるのに対し、SL1B1による分解はpH6.0の条件下であり、我々は真に実用的な微生物の取得に成功したと言える。
性質の異なる分解菌を組み合わせることで、より油脂の分解効果の高い複合微生物製剤の開発を目指し、リパーゼ分泌細菌SL1B1とグリセロール資化酵母SL1B2の混合培養を試みた。その結果、SL1B1株の純粋培養では残存していたグリセロールが分解されただけではなく、油脂の加水分解速度、脂肪酸の消費速度までも劇的に加速された。しかし、SL1B1株とSL1B2株の混合培養によるリパーゼ活性は純粋培養と違いはなかった。リパーゼが触媒する油脂の脂肪酸とグリセロールへの加水分解は可逆反応である。培養上清の酵素比活性が同じであるにも関わらず混合培養により加水分解速度が上昇したということは、生成物であるグリセロールが消費されたことにより可逆反応が分解反応の方向に向かったことを意味している。このような共生微生物の効果はこれまでに報告例がなく、画期的な新技術であると同時に、グリーストラップに適用可能な微生物製剤の実現に近づいたと言える。
微生物製剤とバイオフィルムの品質管理技術として、16S rDNAおよび26S rDNAを標的とした評価法(変性剤濃度勾配ゲル電気泳動-DGGE解析)を確立した。SL1B1株とSL1B2株を含む混合微生物製剤を定期的にグリーストラップに導入したところ、ノルマルヘキサン抽出物量が劇的に減少した。そこで、実際にグリーストラップ内に製剤微生物であるSL1B1株とSL1B2株が存在しているかどうかについて調べた。その結果、油脂分解混合微生物製剤としてグリーストラップに導入した細菌SL1B1株および酵母SL1B2株は、製剤導入前には確認されなかったが、微生物製剤を5日間、毎夜導入した後の翌日の昼間には確認された。
微生物製剤の保存技術の開発については、適切な保護材の適用により、凍結乾燥保存で、5℃、7ヶ月、微生物製剤の活性を維持する技術を確立した。
英文要約The purpose of this research is to develop technologies for introducing microbial materials for functionalization and stabilization of biofilms degrading oils and fats in grease traps for treatment of waste water from the kitchen. The followings are main results.
As the waste water in grease traps is generally a weak acid due to autohydrolysis of triacylglycerol, we screened oil-degrading microorganisms at pH 6.0. We have isolated from soil the bacterial strain Burkholderia arbolis SL1B1, which secrets lipase and utilizes triacylglycerol as the sole carbon source. This strain metabolizes free fatty acids but hardly does glycerol produced from triacylglycerol by lipase. We have also isolated the yeast strain Candida cylindracea SL1B2, as a symbiotic strain with the strain SL1B1. This strain SL1B2 does not secret lipase and therefore cannot hydrolyze triacylglycerol. Although the yeast cannot metabolize free fatty acid, but utilizes glycerol as the sole carbon source for growth. The strain SL1B1 demonstrated as high degradation ability at even pH 6.0 as the bacterium previously showed the highest degradation ability at pH7.0. In addition, co-cultivation with C. cylindracea SL1B2 increased the rate of oil degradation by B. arbolis SL1B1 nearly 2-fold. Our results clearly demonstrated the symbiotic effectiveness of the glycerol-assimilating yeast SL1B2 and the lipase-secreting, fatty acid-assimilating bacterium SL1B1 on the enhancement of TAG degradation. The hydrolysis of TAG was enhanced although lipase activity was almost the same in the mixed and the pure cultures. The hydrolysis reaction of TAG into fatty acids and glycerol is a reversible reaction. By eliminating the reaction products the reaction is enhanced in the direction of hydrolysis.
We have also established the evaluation method for proving the presence of the introduced microorganisms in a grease trap using DGGE as a quality control technology for microbial materials and biofilms. After periodical introduction of SL1B1 and SL1B2 into a grease trap, n-hexane extracts dramatically decreased. We examined the presence of these two strains. As a result, these two strains were detected in the waste water in the grease trap at the next day after the introduction of the microorganism material at night but were not detected before the periodical introduction.
In the study for the development of a preservation method of microbial materials, we have succeeded in maintaining microbial activity for 7 months at 5C in freeze drying by using appropriate preservatives.
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