成果報告書詳細
管理番号20100000001991
タイトル平成18年度-平成21年度成果報告書 環境安心イノベーションプログラム「植物機能を活用した高度モノづくり基盤技術開発/植物の物質生産プロセス制御基盤技術開発」葉緑体における物質生産プロセスの解析および制御基盤技術開発
公開日2010/11/10
報告書年度2006 - 2009
委託先名財団法人地球環境産業技術研究機構
プロジェクト番号P02001
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約本研究プロジェクトでは、植物の基幹代謝系である葉緑体に注目し、植物を工業原料生産プロセスとして活用するのに必要な基盤技術の確立を目的としている。この目的に従って、中間評価以後の4年間(平成18年度-21年度)、京都府立大、名古屋市立大、大阪大およびRITEで研究コンソーシアムを結成し、主に以下の研究開発を実施した。1)葉緑体遺伝子発現転写過程での制御:2)葉緑体遺伝子発現翻訳過程での制御:3)代謝系のメタボローム解析:4)基幹代謝系改変植物の作出。「葉緑体遺伝子発現転写過程での制御」のテーマでは、Sig5を誘導的に発現させることにより、psbD LRP制御下の遺伝子発現を誘導的に活性化する技術開発をおこなった。また、葉緑体DNAマイクロアレイを用い、各組織で特異的に働くプロモーターの同定・カタログ化に取り組んだ。さらに、低温、塩、高浸透圧、エリシター、傷害などの処理に対する葉緑体遺伝子の網羅的発現解析を実施し、低温、塩、高浸透圧に対して、唯一psbD LRPが活性化されることを見いだした。一方、傷害に対しては、rrn5Sの発現が特異的に抑制されることを明らかにした。また、「葉緑体遺伝子発現翻訳過程での制御」のテーマでは、タバコ葉緑体in vitro翻訳活性を約100倍高める改良を実施し、短時間で高感度の翻訳効率測定を可能とした。さらにこの系を用いて、翻訳効率の高い葉緑体mRNAを選出したほか、同義コドン間の翻訳効率を実験的に解析し、同義コドンの使用頻度と翻訳効率が必ずしも一致しないことを明らかにした。このほか、コード領域の翻訳効率に与える影響について解析し、コード領域も翻訳効率に大きく関与することを見出した。特にコード領域の5'末端より30コドンの領域で強い翻訳が見られ、この領域が翻訳効率に大きく関与することを見出した。また、タバコとエンドウにおいて、葉緑体RNAのエディティング部位を明らかにし、RNAエディティングに必要なシス配列とトランス因子を検出した。一方、「代謝系のメタボローム解析」のテーマでは、モノリス型キャピラリーHPLCカラムシステムを分離手段としたマイクロHPLCシステムを構築し、従来型LC-MSシステムの100倍超の高感度を達成したほか、GC-MSによる親水性低分子化合物のプロファイリングシステムを開発し、データマイニングシステムも合わせて開発した。また、スプレイヤーチップ一体型ナノカラムの作成及び質量分析器との組み合わせにより、生体内で極微量しか存在しない植物ホルモンを数100アトモル-数フェムトモルの絶対感度で観測する技術を確立した。さらに、「基幹代謝系改変植物の作出」のテーマでは、植物の基幹代謝経路であるカルビンベンソン経路を主な対象にLC-MS、CE-MS及び13Cラベルを用いた代謝フィンガープリンティング/炭素フロー測定技術を開発し、葉緑体内における炭素フローを測定した。また、イソプレノイド代謝経路をモデル代謝経路として取り上げ、遺伝子組換えによる代謝改変を実施した。これにより、著量のイソプレノイド化合物を蓄積できるモデル植物を開発した。
英文要約Title: Development of Fundamental Technologies for Controlling the Material Production Process of Plants. Development of Fundamental Technologies for Controlling the Material Production Process in Chloroplasts. (FY2006-FY2009) Final Report
The purpose of this project is to develop the basic technologies to produce industrial commodity chemicals by using the inherent ability of plants to produce chemicals. To achieve this purpose, we established a research consortium which, from FY2006 through FY2009, undertook the work under the theses described below: # Regulation of chloroplast genes at the transcriptional level; # Regulation of chloroplast genes at the translational level; # Metabolic analysis of plant chloroplasts; # Metabolic engineering of the central metabolic pathways in chloroplasts. For the first thesis titled “Regulation of chloroplast genes at the transcriptional level”, we developed a technique to control gene expression under psbD LPR regulation by the induction of Sig5 expression. To obtain novel promoters which can function in chloroplasts, we analyzed chloroplast gene expression mechanisms by using DNA microarray and identified several tissue-specific promoters. Furthermore we researched stress responsible promoters that function in chloroplasts and found that psbD LRP promoter is induced under low temperature, salt, osmotic and injured stress. On the second thesis titled “Regulation of chloroplast genes at the translational level”, we tried to improve translational activities of our in vitro translation system and achieved 100-fold higher activities than those of conventional techniques. Subsequently by using this system, we found several mRNA sequences which showed efficient translation-level activities in chloroplasts. Furthermore we studied the dependence of translation efficiency on mRNA coding sequence and found that around the 30th codon downstream from 5′ terminus of mRNA coding region is strongly involved translation efficiency. For the third thesis titled “Metabolic analysis of plant chloroplasts”, we constructed a new micro HPLC system using monolith-type capillary column, which showed 100 times higher sensitivity than conventional HPLC systems to detect several chemicals. We developed a new nano-flow LC-MS system which shows good detection sensitivities at the level of hundreds attomole per liter combining a nano column integrated sprayer chip with a MS analyzer to study plant hormone molecules contained in ultralow volumes in cells. In the research of the fourth thesis titled “Metabolic engineering of the central metabolic pathways in chloroplasts”, we developed a metabolite finger printing / carbon flow detecting system by using LC-MS, CE-MS, and in vivo 13C labeling methods, and analyzed carbon flows in tobacco chloroplasts. On the other hand, by using chloroplast engineering technique, we constructed transplasmic plants which accumulated high amounts of isoprenoid chemicals in tobacco.
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