成果報告書詳細
管理番号20100000001509
タイトル平成20年度成果報告書 平成20年度第2回採択産業技術研究助成事業 08C46542a 生細胞内多種タンパク質間相互作用を同時検出する発光スクリーニング法の開発 平成20年度中間
公開日2011/1/8
報告書年度2008 - 2008
委託先名国立大学法人東京大学小澤岳昌
プロジェクト番号P00041
部署名研究開発推進部
和文要約タンパク質間相互作用検出プローブの開発を目的として、コメツキムシ由来のルシフェラーゼの新たな切断位置(N末側1-415アミノ酸、 C末側394-542アミノ酸)をライブラリースクリーニング法により決定した。バックグラウンド発光に対して、リガンド刺激時におよそ100倍発光上昇するプローブを開発した。GPCRとβ-arrestinタンパク質との相互作用を指標とした、GPCRに作用するケミカルライブラリースクリーニング用細胞5種類を開発した。開発した細胞は、96穴マイクロプレート上でリガンド刺激後わずか10分で高感度にアッセイできることを実証した。多色ルシフェラーゼの開発では、大腸菌にルシフェラーゼ変異体を発現させ、色変異体のルシフェラーゼを選択的に回収できるスクリーニング系を開発した。ランダムに遺伝子変異を導入したルシフェラーゼから、赤色変異体を同定することに成功した。
英文要約We identified a new pair of amino-terminal (1-415 amino acids) and carboxy-terminal (394-542 amino acids) fragments of a click beetle luciferase (Brazilian Pyrearinus termitilluminans) using semi-rational library screening. The identified fragments were applied to the study of five G-protein coupled receptors (GPCR) that interact with β-arrestin on the plasma membrane. By generating cell lines stably expressing the GPCRs and β-arrestin connected with the luciferase fragments, we demonstrated rapid and sensitive screening of potential chemicals that act on GPCRs using a 96-well microtiter plate format. The screening time was reduced to 5-10 min after ligand stimulation.
A screening system was developed for isolating an E. coli which includes luciferase mutants generated by a random mutagenesis. We demonstrated that the system enabled to collect mutant luciferases whose color changed from orange to red in a high-throughput manner.
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