成果報告書詳細
管理番号20100000002286
タイトル平成21年度成果報告書 平成21年度第1回採択産業技術研究助成事業 09A01013a 一本鎖抗体集積化チップを用いるバイオマーカー糖鎖プロファイリング診断システムの開発 平成21年度中間
公開日2011/1/25
報告書年度2009 - 2009
委託先名国立大学法人京都工芸繊維大学熊田陽一
プロジェクト番号P00041
部署名研究開発推進部
和文要約モデル抗原5種に対する一本鎖抗体(scFv)の遺伝子を全合成し、PS-tagを導入したscFv-PS、scFv-(PS)、scFv-PSIIの生産を行った。Overnight Express培地を用いるマイクロプレート培養を検討し、宿主・ベクター系、培養温度、攪拌回転数等を最適化することで、当初の目標を大きく上回る平均1mg/mLの生産性を得た。さらに、遠心分離、菌体破砕、インクルージョンボディからのPS-tag融合scFvの精製をマイクロプレートベースで実施可能であることを見出した。今後、PS-tag融合scFvの固定化ならびに抗原結合活性を評価していく。疎水性PSプレートの表面に低圧酸素プラズマ照射を施すことでPS plateの親水化に成功した。親水性PS表面に対してPS-tagが従来よりも高い親和力で付着することを見出した。共存尿素濃度ならびに添加剤の影響を検討し、On-Chip Refolding操作の条件を最適化した。本法は、scFvのみならず、FvやFabに対しても有効であった。従来よりも抗原結合活性を20%以上向上でき、whole抗体を固定化したPS plateとの比較実験から25倍の高感度化に成功した。
英文要約In this study, we developed a high-throughput production system of PS-tag-fused recombinant antibody fragments such as scFv and Fab, utilizing microplate-based culture. By use of Overnight ExpressTM auto-induction system, much high cell concentration and scFv productivity (~ 1mg/ml) were achieved. Furthermore, the hydrophilic PS surface that PS-tag can recognize was successfully produced by O2-plasma irradiation against the conventional hydrophobic PS surface. The condition for on-chip refolding of PS-tag-fused scFvs was optimized, and consequently, the highest antigen-binding activity was obtained after on-chip refolding in the presence of 0.5 ~ 4M urea and 0.1 - 1% Tween 20 as additives. Under above conditions, not only PS-tag-fused scFv, but also PS-tag-fused Fv and Fab could be refolded on the surface of hydrophilic PS plate. Judging the results of sandwich ELISA, scFv-immobilized plate showed 25-fold higher sensitivity in comparison with mAb-immobilized plate.
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