成果報告書詳細
管理番号20100000002338
タイトル*平成21年度中間年報 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術開発) バイオ燃料植物ヤトロファの油脂生産最適化技術の開発
公開日2011/1/8
報告書年度2009 - 2009
委託先名株式会社植物ハイテック研究所 国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学 国立大学法人琉球大学
プロジェクト番号P07015
部署名新エネルギー技術開発部
和文要約和文要約等以下本編抜粋:1. 研究開発の内容及び成果等
本事業では、後背地での栽培が可能なバイオディーゼル燃料(BDF)生産植物ヤトロファ(ジャトロファ)・クルカス(Jatropha curcas L.)ヤトロファについて、その種子の脂質代謝を植物工学的に改善する技術を開発し、ヤトロファのBDF原料生産能力を最適化するための基盤技術を開発することを目的に、本年度は以下の項目について研究開発を行った。
(1)種子のプラスチドでより強い発現を示すプロモーターの調査(担当:株式会社植物ハイテック研究所)
油糧植物であるヤトロファの種子には通常30%程度の油脂を含むが、もしこれを40%程度の含量に増強することができれば産業的寄与は大きい。植物の油脂含量を増強するためには、脂肪酸合成経路におけるキー酵素の改変が一つの方法である。植物における脂肪酸の新規合成はプラスチド内で行われるが、その初発反応であるacetyl-CoAカルボキシラーゼ(ACCase)によるmalonyl-CoAの生成が脂肪酸合成全体の律速過程であることが知られている。我々は、プラスチド内で機能するACCaseを構成する遺伝子accD(プラスチドゲノムにコードされている)に着目し、そのプロモータを改変し発現量を増加させることにより植物に含まれる脂肪酸量が10%程度増強することをモデル植物であるタバコを用いて明らかにした。本研究開発は、モデル植物であるタバコで得られたこの成果を実用植物であるヤトロファで具現化しようという取り組みである。このためには、1.(種子の)プラスチドでより強い発現を促すプロモータの選定、2.そのプロモータのaccD遺伝子上流への導入のためのベクター作製、3.ヤトロファプラスチド形質転換体の取得、および4.得られたプラスチド形質転換体の脂肪酸含量に関する評価が必要である。これらを行うことにより、ヤトロファ種子中の脂肪酸量を増強させる技術を確立することが、本研究開発の目的である。平成21年度は、1.(種子の)プラスチドでより強い発現を促すプロモータの選定、および2.そのプロモータのaccD遺伝子上流への導入のためのベクター作製の一部を行った。葉緑体ゲノムへの外来遺伝子の導入は相同組換えにより起るため、ヤトロファ葉緑体ゲノムの対象とする相同領域の塩基配列を得る必要がある。この相同領域として、accD 遺伝子の発現強化を目的としているので、rbcL-accD 領域を用いることにした。これら相同領域を得るには、PCR法により対応する遺伝子断片を得るのが最も簡便である。そこで鋳型となるヤトロファ葉緑体ゲノムDNAを得るためにヤトロファ葉緑体の単離を常法に従って行った。パーコールを用いた密度勾配遠心により、葉緑体画分を得た。この画分を蛍光顕微鏡で観察すると、そこに存在する顆粒の大半が葉緑体特有の赤色の蛍光を発することから、ヤトロファ葉緑体の単離に成功したと結論した。この葉緑体から葉緑体ゲノムDNAを単離,精製しPCRのための鋳型DNAとした。また、タバコ葉緑体遺伝子プロモータの発現程度、組織特異性を参考に構成的に発現するプロモータとして、rrn, rpl23, 葉緑体で強力に発現するプロモータpsbA, 非光合成組織で強く発現するclpを選定した。これらの遺伝子プロモータを公開されているヤトロファ葉緑体ゲノム全塩基配列情報をもとにそれぞれのプライマーを合成し、PCR法により各プロモータを単離・精製した。
英文要約Summary for the Annual Report
Project title: Research and Development on the Optimization of bio-diesel production in Jatropha curcas. (FY2009 -FY2010) FY2009 Annual Report
Reporters: Nara Institute of Science and Technology
Plant High-Tech Laboratory Ltd
University of the Ryukyus
J. curcas is expected as one of the most promising resources for the production of bio-diesel. To maximize its productivity, optimization of its lipid biosynthesis through molecular breeding is the key technology to be established. Towards this end, we focused on the metabolic profiling and metabolic engineering of Jatropha seed lipids. To obtain information on the lipid biosynthesis-related gene expression in the fruits of Jatropha, we harvested total RNAs from flowers and fruits at six time points during flowering to fruit maturation. Subsequently, we synthesized cDNAs from these RNAs, and subjected to the gene expression analysis by the next-generation sequencer. As a result, we obtained 350 million base-pairs of Jatropha expression sequence tags (ESTs) from each time point of the harvest. Approximately 70% of the Jatropha sequence had significant sequence homologies with those in the other higher plants such as Arabidopsis. Frequency analysis of the ESTs suggested the massive change in the gene expression profile of several lipid-related genes during seed maturation in Jatropha. Jatropha seeds contain several fatty acid components, of which oleic acid and linoleic acids occupy approximately 30% each of the total fatty acids. Since oleic acid has higher cetane value over other fatty acids and is preferable as an ingredient for biodiesel fuel, we attempted to increase the amount of oleic acid in the Jatropha seeds. To this objective, we cloned two cDNAs for ω-6 desaturase, the enzyme responsible for the conversion of oleic acid to linoleic acid. We sub-cloned the cDNA fragments into an RNAi vector so as to suppress the gene expression of two genes. The strategy is to promote the accumulation of oleic acid by decreasing the metabolic flux from oleic acid to linoleic acid. We inoculated Jatropha explants with an Agrobacterium tumefacience containing the RNAi vector. The modification of the key enzyme in the fatty acid synthesis route is one method to reinforce an oil and fat content of the plant. We have chosen acetyl-CoA carboxylase D gene coded in the plastid genome as the key enzyme. This year we constructed the plastid transformation vector for the modification of accD, and established regeneration process from Jatropha explants for the plastid transformation. To increase the fruit yield per unit area, we checked the effects of plant growth regulators spraying on the young fruit in terms of the fruit growth. Jatropha fruits are not only oil production but also produce abundant biomass resources potentially, such as pulp, coat, seed cake, etc. Therefore, the high active substance was separated and extracted from the plant residues, pruned branch and residues of after BDF extraction. In this year, the carbonization machine was developed, and extraction and carbonization of the active component were tried using fruits, pulps, seed cake and leaf. Phorbol ester was analyzed for the dried residue by HPLC.
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