成果報告書詳細
管理番号20100000002417
タイトル平成19年度-平成21年度成果報告書 基礎研究から臨床研究への橋渡し促進技術開発/橋渡し促進技術開発 間葉系幹細胞を用いた再生医療早期実用化のための橋渡し研究
公開日2011/1/8
報告書年度2007 - 2009
委託先名(独)産業技術総合研究所
プロジェクト番号P07022
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約研究開発項目(1) 間葉系幹細胞の分離・増殖最適化
(1)-1.間葉系幹細胞の細胞表面マーカー検証(器官発生工学研究ラボ)
ヒト間葉系幹細胞樹立株を利用した心筋分化誘導系を構築し、各種細胞表面マーカーの発現と拍動する心筋分化能との相関を検討した。また、アクチニン、cTnT、コネキシン43などの各種心筋特異的マーカーで染色することにより機能的な心筋へと分化していることも確認した。その結果、N-カドヘリンの十分な発現と心筋分化能との間に相関が確認された。さらに様々なヒト初代間葉系幹細胞や市販細胞を用いて心筋分化能の測定を行った結果、初代間葉系幹細胞においても、N-カドヘリンが心筋へ分化しやすいヒト間葉系幹細胞の細胞表面マーカーとして有用であることが示された。さらに、心移植で危惧される骨化能との関連についても検証を行ったが((1)-3参照)、N-カドヘリンが十分高い発現を示す幹細胞でも心移植後の骨形成は全く認められないことから、骨化の危険性とは相関しないと考えられる。以上の結果から、心臓治療の目的で有用な高い心筋化能をもつ間葉系幹細胞の評価項目として、細胞表面マーカーN-カドヘリンが有用であることが検証された。
(1)-3.間葉系幹細胞の増殖・分化比較検証(セルエンジニアリング研究部門・関西)
我々は現在、間葉系幹細胞の細胞源として患者の骨髄を利用している。近年、脂肪組織は容易に大量の採取が可能なことから、間葉系幹細胞の細胞源として脂肪組織由来間葉系幹細胞(ADSC)が非常に注目され、利用されつつある。治療に即した細胞源を見極めるため、骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)およびADSCの細胞の性質について比較検証を行った。F344ラットのBMSCおよびADSCを用いた場合、in vitroでの骨分化能, 皮下移植での骨形成能ともBMSCはADSCよりも有意に高かったが、同系ラット心筋梗塞部位への移植ではBMSCは骨形成を示さなかった。ヒト細胞を用いても同様の比較検証を行ったところ、BMSC、ADSCともにin vitroでの骨分化能, 皮下移植での骨形成能を示した。そのうち高い骨形成能を示すADSCをヌードラット心筋梗塞部に移植したところ、細胞の一部は生着しているが、骨形成は認められなかった。これらの結果から、ヒトBMSC、ADSCは増殖・骨分化に有意な差はなく、ともに心疾患に応用できうるといえる。
 研究開発項目(2) 間葉系幹細胞の品質検証
(2)-1.間葉系幹細胞の染色体異常解析(セルエンジニアリング研究部門・つくば)
 間葉系幹細胞を再生医療に用いるためには間葉系幹細胞の品質保証が最重要課題である。癌化は染色体レベルの異常に起因することが確立されていることから、染色体の異常を簡便・迅速に検出する方法として人工染色体(BAC)アレイCGH法が有力である。当該プロジェクトではモンゴリアン系のBAC-アレイCGH法を用いて、間葉系幹細胞の品質評価法の確立を行なった。BAC-アレイCGH法を用いてHeLa細胞などの培養癌細胞が継代培養により染色体異常に変化を生じること示した。また、BAC-アレイCGH法を用いて臨床で用いた間葉系幹細胞由来DNAの評価を行なった結果、培養増殖させた患者由来の間葉系幹細胞のDNAの染色体構造に異常が見られなかった。これらの結果からBAC-アレイCGH法は短時間で簡便に間葉系幹細胞の染色体異常を検出できる評価法として有用であった。
英文要約Title: Technological Development Projects for Prompt Bridging Between
Fundamental Studies and Clinical Application. Developments toward Prompt
Application of Regenerative Medicine with Mesenchymal Stem Cells (MSCs).
(FY2007-FY2009) Final Report
1-1. Evaluation of the cell surface markers of MSCs
The aim of this study is to validate useful cell surface markers
specifically expressed in the stem cells or progenitors that can
contribute for the regeneration of cardiomyocytes. GFP-labeled human MSC
lines were cultured on feeder cells and the ratio of GFP-positive beating
cardiomyocytes were quantified. Expression of various terminal markers,
such as actinin, connexin 43, and cardiac Troponin T were also monitored
by immunofluorescent staining. Among various candidate markers, the
expression of N-cadherin was associated with the ability of cardiomocyte
differentiation. Human MSCs that express high level of N-cadherin failed
to show ossification when the cells were transplanted into nude rat heart,
suggested that N-cadherin expression does not associate with ossification.
These results indicate that N-cadherin is a useful cell surface marker of
MSCs that efficiently differentiate to cardiomyocytes and contribute
cardiac therapy.
1-3. Comparison of the bone marrow derived MSCs with the adipose tissue
derived MSCs
MSCs reside in many types of tissue are able to differentiate into various
functional cells including osteoblasts. The purpose of this study is to
compare the osteogenic differentiation capability between bone marrow
derived MSCs (BMSC) and adipose tissue-derived MSCs (ADSC). Rat BMSC
(rBMSC) and ADSC (rADSC) were analyzed the proliferation, cell surface
markers, osteogenic differentiation and in vivo bone formation activities.
Human BMSC (hBMSC) and ADSC (hADSC) also analyzed them. To ascertain the
possibility of bone formation in cardiac tissue, rBMSC and hADSC having a
high osteogenic capability were implanted into rat model of myocardial
infarction. Bone formation was not observed in both of experiments. Thus,
hBMSC and hADSC might be available for cardiac diseases.
2-1. Evaluation of Chromosomal Stability of MSCs by BAC Array CGH Method
To use MSCs for regenerative clinical treatment, the most important issue
is the safety of the implant cells. As cancer is established to be caused
by chromosomal abnormalities, an effective way to evaluate the process of
carcinogenesis, an array CGH, a-CGH, method, using bacterial artificial
chromosome, is a simple and clear method. Firstly Hela cell line, an
established cancer cell line, was evaluated by BAC a-CGH. The chromosomal
abnormalities were clearly identified. Using BAC a-CGH the chromosomal
stability of MSCs, used in clinical application, were evaluated. BAC a-CGH
has been proved to be a simple, clear and time-saving method to evaluate
the chromosomal stability of stem cells for regenerative medicine.
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