成果報告書詳細
管理番号20100000001560
タイトル平成18年度~平成21年度成果報告書「機能性RNAプロジェクト」
公開日2011/4/20
報告書年度2006 - 2009
委託先名社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム
プロジェクト番号P06011
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約研究開発項目1.「機能性RNAの探索・解析のためのバイオインフォマティクス技術の開発」
機能性RNAを検索・発見するためには、2次構造を考慮した配列情報解析技術が不可欠である。本プロジェクトでは、超高速・正確な構造アラインメント技術、最高精度の2次構造予測技術、構造を考慮したRNA検索技術、高精度のマイクロRNA予測技術の開発に成功した。これらの技術を活用したヒトゲノム配列の網羅的な解析によって得られた1万個以上の新規機能性RNA候補を同定した。さらに、独自に設計したカスタムマイクロアレイによる発現解析により、1500個以上の高発現の新規機能性RNAを発見した。また、既知の機能性RNA、予測機能性RNA、その他のゲノム因子等50万配列以上を網羅した機能性RNAデータベースを構築して公開するとともに、ユーザ認証機能を用いた統合的な解析環境をプロジェクト内の研究グループに提供して共同研究を推進した。機能性RNAデータベースと同時に開発した次世代シークエンサー配列解析技術は、機能性RNA研究のみならず、エピゲノム解析等、今後のゲノム解析の情報基盤を提供するものである。
研究開発項目2.「機能性RNA解析のための支援技術・ツールの開発」
機能性RNA研究およびRNA創薬の開発を強力に推進するためには、新しい技術・ツールの開発が必要である。本プロジェクトでは、RNAを高感度で検出・解析するための手法として、RNAマススペクトロメトリー(RNA~MS)を開発し、プロジェクトの最終目標値であるサブフェムトモルオーダーでのRNAの微量解析に成功した。本手法を駆使することで、機能性RNAに含まれる修飾部位の同定やマイクロRNAの直接プロファイリングなどが可能となった。また、膨大な質量情報を情報処理する技術を開発し、RNA~MSは機能性RNA研究のみならず、RNA創薬や核酸医薬の開発を強力にサポートする基盤技術に成長した。また、RNAの高感度検出に関しては、多重伸長反応法や光化学反応法を利用した新規の手法を開発した。さらに、RNA創薬を実現するためには、安価で高品質なRNAの供給が不可欠である。新規なRNA化学合成技術を駆使することで、長鎖RNAの合成が可能となり、RNA創薬において、実用可能な基盤技術に成長した。
研究開発項目3. 「機能性RNAの機能解析」
(1) ヒト疾患に関連する機能性RNAの迅速で高効率な同定
医薬品開発に結びつく有用な機能性miRNAを取得し、疾患や重要な生理現象における作用機構を明らかにすることを目標に研究を実施した。アレルギー疾患モデルのマスト細胞からの脱顆粒、癌細胞増殖、iPS細胞作出効率を制御する機能性miRNAと標的遺伝子を複数同定した。さらにマウスのゼノグラフトモデル、ノックアウトマウスを利用して個体レベルでのmiRNA効果を実証し、医薬品開発の道筋を整備した。
(2) 機能性RNAに関する基盤的知見の獲得とそれを基にした機能性RNA同定
機能未知のncRNAに関する新規基盤則を見出し、それを基にした機能解明を目標に研究を実施した。長鎖ncRNAの核内局在情報を起点に、新規解析法の開発と機能解析によって新しいncRNA機能を複数発見した。診断マーカーとして有用な疾患発症により発現変動するncRNAやアンチセンスRNAを数多く同定した。さらにncRNAと相互作用する疾患関連タンパク質を多数同定した。miRNAに続く低分子ncRNAの新カテゴリーとしてesiRNA、piRNAを同定し、これらがゲノム安定性維持に寄与していることを見出した。またpiRNAの新規な生合成経路を見出した。この他にヒトやマウスのmiRNAとパートナータンパク質の結合情報を取得した。
英文要約1.Bioinformatics for nc RNAs
(1)Sequence analysis technologies for ncRNAs
Software tools for super fast and accurate structural alignment, secondary structure prediction of maximum expected accuracy and sequence search with secondary structures are developed.
(2)Finding of new ncRNAs
More than 10,000 new ncRNAs have been identified. Expression analysis using designed custom microarray revealed more than 1,500 highly-expressed ncRNAs.
(3)Functional RNA database
Sequence database for functional RNA (fRNAdb) that cover more than 50 entries of sequences and specialized Genome Browser for functional RNAs (UCSC GenomeBrowser for functional RNAs) have been developed. They support secure integration of unpublished data with the database entries. Automated system for the information analysis of next generation sequencing data is also developed.
2.Supporting technologies and analytical tools for ncRNAs
(1) RNA mass spectrometry
To obtain insights into the functional aspects of ncRNAs, it is necessary to develop innovative technologies and novel analytical devices to characterize limited quantity of cellular RNAs. Direct analysis of RNA molecules by mass spectrometry (RNA-MS) enables rapid and quantitative analyses of ncRNAs, such as rapid identification of RNA gene by RNA mass fingerprinting, and miRNA profiling for diagnostic purpose. In addition, RNA-MS enables qualitative analysis of cellular RNAs with base modifications and terminal chemical structures. This group successfully analyzed a limited quantity of RNA molecules (subfemto mole order) by optimizing high sensitive detection system using capillary LC nano ESI mass spectrometry. To maximize the utilization of RNA-MS, this group developed an automated machine for RNA isolation using the reciprocal circulating chromatography (RCC).
(2) Chemical synthesis of RNA for pharmaceutical application
Chemical synthesis of long RNA oligomers with high quality is a critical technology for expanding field of RNA-based therapies. This group has developed a new synthetic method utilizing 2-cyanoethoxymethyl (CEM) group as a 2'-hydroxyl protecting group. By optimizing the coupling and capping conditions of phosphoramidite chemistry, this group successfully synthesized mRNA with 5’ cap structure and poly A tail.
3.Functional analysis of ncRNAs
(1) Efficient identification of disease related-functional ncRNAs
The miRNAs that are involved in cancer cell proliferation or allergic reaction have been identified. The suppression of cancer cell proliferation caused by the introduced miRNA was confirmed sustainable for a long period in mouse zenograft models. The miRNA knockout mouse exhibited female sterilitic phenotype that was caused by defect of pituitary hormone synthesis. The miRNAs that facilitates iPS cell production has been identified.
(2) Establishment of the fundamental rules of ncRNA function
Novel functions of long ncRNAs involved in nuclear architecture and transcriptional control have been discovered by employing the newly developed RNA knockdown system. The ncRNAs and antisense ncRNAs that are potential diagnostic markers in various cancers have been identified. Large numbers of endogenous siRNAs and piRNAs have been identified in Drosophila. The unique biogenesis pathway of piRNAs has been established. The miRNAs that associated with the specific human Ago proteins have been characterized.
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