成果報告書詳細
管理番号20110000000133
タイトル平成21年度成果報告書 新規悪性腫瘍分子プローブの基盤技術開発 分子プローブ要素技術の開発
公開日2011/4/20
報告書年度2009 - 2009
委託先名国立大学法人東京大学大学院新領域創成科学研究科
プロジェクト番号P08029
部署名バイオテクノロジー医療技術開発部
和文要約糖鎖に対する抗体の作成は、自己寛容であることが多く難しい。そのため、糖鎖を認識するプローブとして、抗体以外のアプローチが必要である。我々は、レクチンファミリーの中で糖結合特異性の多様な植物マメ科レクチンをスキャフォールドとして用い、このレクチンの糖結合部位を形成するvariable binding loopにランダムなアミノ酸を導入したレクチンライブラリーを作成し、この中からがん糖鎖抗原と結合性を有する複数のクローンを探索し、それらの改変レクチンを大量に調製することを試みた。
改変レクチンのスクリーニングは、BWZ36あるいは2B4のレポーター細胞表面にBPA改変レクチンを発現させ、そのレクチンから細胞内にシグナルを送りレポーター遺伝子を発現させるcell surface display法を前年度確立した。この手法は、一つの細胞に一遺伝子を導入するレトロウイルスを用いて、正しくフォールディングしたタンパク質を選択的に哺乳動物細胞に発現する系であり、陽性クローンを容易に増殖できるという特徴をもっている。しかしながら、発現量が少ないこと、さらに糖鎖との結合によるシグナルが弱いという欠点が明らかになった。今年度は新たに7種類のマメ科レクチン遺伝子を単離し、同様の発現系を構築したところ、レクチンの種類によってさまざまな問題点があることがわかったが、その中で、abcレクチンは細胞表面における発現が高いこと、また認識する糖鎖特異的にシグナルが細胞内に伝わり、感度良くアッセイできることがわかった。
そこで、abcレクチンをスキャフォールドとして、新たな改変レクチンライブラリーを作成した。また、レポーター細胞であるBWZ36と2B4細胞を比較したところ、BWZ36細胞は形質転換効率が優れているが、セルソーターによる選別後の増殖が悪く、スクリーニングに長時間を要するという欠点があった。一方、2B4細胞は形質転換効率は低いものの、増殖能が高く、スクリーニングを短時間で繰り返すことができるメリットがあり、後者のGFPをレポーターとする2B4細胞を用いてスクリーニングを行うことにした。
作成した改変レクチンライブラリーを2B4細胞に形質転換し、Tn糖鎖抗原やLewis X抗原を含む6種類の糖鎖を用いて、これらに特異的に結合する改変レクチン発現細胞の選別を行った。GFP陽性の上位1%以内の細胞集団を選別するソーティングの操作を3回繰り返したところ、いずれもそれぞれの糖鎖と特異的に結合する細胞数の割合は5-30%程度まで濃縮された。cell surface displayの系は、改変レクチンの発現量と改変レクチンと糖鎖との親和性の総和でGFPの発現量が決まる。スクリーニングの目的は、あくまで糖鎖との親和性の高いクローンを選別することから、これを定量する方法として、改変レクチンのN末端に発現させたmycタグに対する抗体と、誘導されるGFPの量を同時に検出することにより、糖鎖との親和性の高いクローンを選別することのできる系でクローンの選択を行った。
Tn糖鎖抗原に特異的なクローンを数種類取得し、これら改変レクチンの塩基配列を特定すると共に、大腸菌の発現ベクターに組み込み、組換え体改変レクチンの大量発現を試みた。pET3cベクターに組み込んだ改変レクチン遺伝子は、IPTGにより発現誘導し、封入体として回収した。グアニジンで可溶化後、アルギニン存在下でリフォールディングを行い、Mono-Q陰イオン交換カラム、およびゲルろ過クロマトグラフィーにより、精製を行った。
英文要約Antibodies are most powerful tool in bioimaging, especially in cancer diagnostics. However, it is difficult to produce antibodies against sugar chains. We tried to use another approach to obtain imaging probes against cancer-related sugar structures by using leguminous lectins as a scaffold structure. We have previously determined a variable binding loop of leguminous lectins functionally homologous to antigen-binding loop of antibodies. To obtain a imaging probe for a cancer-associated sugar antigen, we constructed lectin library introduced with random amino acid substitutions into variable binding loop, searched for clones specific for a cancer-associated sugar antigen, determined the mutated clones, and expressed mutated lectins in E. coli.
For screening of mutated lectins specific for cancer-associated sugar structures, we first constructed vector of BPA cDNA fused with genes encoding Myc-tag at 5'-end and CD8 transmembrane region followed by CD3 zeta cytoplasmic tail at 3'-end. In this system, BPA lectin was displayed on surface of mammalian cells and cross-linking of the molecule transduced signals into the cell, which harboring NF-AT-induced -galactosidase or GFP genes. When BPA-expressing cells was cultured in the well immobilized with anti-Myc antibody, -galactosidase was strongly induced in the cells. In contrast, the cells cultured on Gal1,3GalNAc-immobilized wells induced -galactosidase slightly. Then we cloned other seven kinds of leguminous lectin genes and constructed the same expression vectors as described above. Among eight kinds of lectins, ABC lectin-expressing cells showed strong induction of -galactosidase by stimulation of sugar ligand. Then we constructed lectin library using ABC lectin cDNA. In the expression cloning, 2B4 cell with a GFP reporter gene had advantage in both expression and growth compared to BWZ36 cell, although transformation efficiency of 2B4 was 2-fold less than that of BWZ36. Using the cell surface display system and six kinds of sugar chains, we successfully enriched cells expressing mutated lectin with desired specificity, from less than 1% to 7-30% of total by flow cytometry. Next, we tried to pick up the clones expressing mutated lectins with high affinity for sugars, from enriched mutated lectin-expressing cells. To clarify the affinity of mutated lectin to sugars, cloned cell was stained with both anti-Myc antibody and sugar ligand, and then we could choose two clones expressing mutated lectins with higher affinity for Tn cancer-associated antigen. The cDNAs encoding the mutated lectins were cloned by PCR, subcloned into pET-3C vector, and transformed into E. coli cells. Recombinant lectins were expressed and recovered as inclusion bodies from the cell lysates. After solubilization with guanidine-HCl and following dialysis against arginine-containing buffer, mutated lectins were purified by anion-exchange and Superdex gel-filtration chromatographies as a single band on SDS-PAGE.
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