成果報告書詳細
管理番号20110000000134
タイトル平成19年度~平成21年度成果報告書 再生医療評価研究開発事業 三次元複合臓器構造体研究開発
公開日2011/4/20
報告書年度2007 - 2009
委託先名国立大学大阪大学
プロジェクト番号P06043
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約間葉系幹細胞由来スキャフォールドフリー三次元人工組織による軟骨再生
我々はスキャフォールドフリー間葉系幹細胞由来三次元人工組織(TEC)を開発し、in vivoでブタ軟骨損傷モデルに移植し、良好な軟骨修復結果を得た。これらの実験は4x105/cm2、2週培養で作成されたTECを移植したものであり、これをさらに臨床応用へと発展させるためには、培養の至適条件を検討する必要がある。このため、TECの培養を細胞密度(4x105/cm2、2x105/cm2)と培養期間(4日、2週、6週)を変えて行い、これを家畜豚の膝関節大腿骨内顆荷重部に作成した径8.5mm深さ1.5mmの軟骨欠損に移植する手術を全身麻酔下に行った。豚の片膝を無作為に選択し移植を行い、反対側の膝は対照のため欠損のままとした。計24頭を術後6ヶ月間飼育した。術後6ヶ月後の修復組織と上記作成条件の相関について検討した。その結果作成条件は修復組織像に影響を与えなかった。しかし移植操作時の作業の効率を鑑み、作成時のTECの力学強度が把持に十分である4x10^5/cm2の細胞密度で2週間の培養期間で作成したTECが最も移植に適したものであると考えられた。また我々はリコンビナント骨形成因子(BMP)がTECの軟骨分化誘導を有意に促進することを確認した。遺伝子導入については超音波を介した導入法を検討したが遺伝子発現が1週間以上持続せず、移植に充分な遺伝子導入法の確立はできなかった。
英文要約Cartilage Tissue Engineering using scaffold-free 3D tissue engineered construct (TEC) derived from mesenchymal stem cells
We have developed a scaffold-free Tissue Engineered Construct (TEC) from mesenchymal stem cells and this technology has been applied to cartilage repair using a porcine chondral defect model. In the previous experiment, culture condition for preparation of TEC was set at 4x105/cm2 in cell density, two weeks for culture duration. In order to maximize the biological potential of the TEC in clinical application, the optimization of culture condition is critical. Therefore, in present experiment, culture condition for preparing TEC was evaluated based on cell density (4x105/cm2 or 2x105/cm2 respectively) and culture duration (four days, two weeks or six weeks respectively). Implantation surgery of TEC was performed under general anesthesia, by creating a chondral defect (8.5mm in diameter, 1.5mm in depth) in a weight-bearing locus of the medial femoral condyle without breaching the subchondral bone. Each TEC was implanted in the created defect in either one limb determined randomly, and in the other limb the defect was created and left untreated. A total of 24 pigs were operated successfully without any major or minor complication and were sacrificed at six postoperative months. We found that neither cellular density nor culture duration affected the morphological quality of the TEC either at macroscopic or microscopic level. In consideration of initial mechanical strength, which must affect the handling at implantation, initial cellular density of 4X105/cm2 and 2 weeks of culture was likely the most appropriate condition for the development of the TEC. Thus we have optimized the development of scaffold-free 3D tissue engineered construct (TEC) derived from mesenchymal stem cells for cartilage repair in terms of development period and initial cellular density at the development of TEC.
Also, we identified that pre-treatment of TEC by recombinant bone morphogenic protein (BMP) significantly promote chondrogenic differentiation of TEC in vitro. Also, we tried gene transfer into TEC using an ultrasound-assisted method. We observed the transgene expression within the TEC for only seven days. Therefore, we could not establish a gene introduction method with enough efficiency of transfection for tissue implantation.
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