成果報告書詳細
管理番号20110000000136
タイトル平成21年度成果報告書 新規悪性腫瘍分子プローブの基盤技術開発 分子プローブ要素技術の開発 ナノ粒子を基盤とした腫瘍志向型近赤外蛍光プローブの開発
公開日2011/4/20
報告書年度2009 - 2009
委託先名国立大学法人京都大学 国立大学法人岡山大学 株式会社島津製作所 片山化学工業株式会社
プロジェクト番号P08029
部署名バイオテクノロジー医療技術開発部
和文要約 標的細胞に結合するペプチド分子を担体なしで、細胞存在下の溶液から探索する技術が開発された。この新規スクリーニング法でA431などのがん細胞に結合するペプチドが見出された。ペプチドにシグナルユニットとしての近赤外蛍光基を結合し、担がんマウス中のインビボ近赤外蛍光イメージングを行ったところ、ペプチドを結合した蛍光基は24時間後もがん細胞に結合して残ることが示された。ただし、この直接スクリーニング法で見出されたペプチドはがん細胞以外の細胞にも強く結合することが明らかになった。そこで、特定のがん細胞と他のがん細胞との結合量の違いを最大にするような差別化スクリーニングが行われた。これについては途中段階ではあるが、いくつかのペプチドについて異なるがん細胞に対する結合量の違いが見出された。またそれらのペプチドについて、共焦点顕微鏡による観察を行い、実際に細胞表面に結合していることが確認できた。以上のように、新規スクリーニング法によりがん細胞結合性ペプチドを簡便に見出すことができた。
 一方、ナノ粒子を基盤とした近赤外蛍光プローブを開発するため、ナノ粒子(リポソーム)に内包する新規近赤外蛍光剤IC7-1の設計・合成を行った。ポリサルコシン~ポリ乳酸型の両親媒性ブロックポリマーの自己組織化により形成されるラクトソームは、直径約30 nmの高分子ミセルであり、疎水性の分子を内包することが出来るIC7-1は疎水性が高く、ラクトソームにIC7-1を内包した蛍光プローブの作製に成功した。また、pH応答性分解型蛍光プローブ開発のため、近赤外の蛍光を消光させる方法について検討し、近赤外に吸収がある金ナノロッド混合により、近赤外の蛍光を効率的に消光させることに成功した。
 さらに、環境応答型シグナルユニットの開発として、スイッチング型プローブであるIC7-1ラクトソームをリポソームに内包する検討を行った。リポソームの作製工程における条件および内包量の検討を行ったところ、目的とする粒子径を維持したリポソームの調製が可能であることが分かった。また、IC7-lactosomeが持つスイッチング機能も保持されていることが判明した。次に、IC7-lactosome内包リポソームの表面に、腫瘍の標的認識ユニットとして選定された抗体を結合させる検討を行ったところ、目的量の標的認識ユニット(抗膜結合型マトリクスメタロプロテアーゼ-1(MT1-MMP)抗体、糖鎖シアリルルイスX(SLX))をシグナルユニットに結合させることができたと考えられた。
 新規近赤外蛍光剤(IC7-1)を両親媒性ポリペプチド(ラクトソーム)ポリマーミセルを介してリポソームに内包化し、標的認識ユニット(抗膜結合型マトリクスメタロプロテアーゼ-1(MT1-MMP)抗体、糖鎖シアリルルイスX(SLX))を表面修飾したIC7-1ラクトソーム内包リポソームを作製してインビボ検討を行った。その結果、本プローブは担がんマウスのインビボ腫瘍イメージングに成功した。
英文要約 A new screening method for discovering cancer-cell binding peptides was developed. When the technique was applied to A431 cells, a new peptide unit was found. A near-infrared fluorophore covalently attached to the peptide remained on the mouse-implanted A431 cells down to 24 h after the injection, whereas the fluorophore without the peptide disappeared within 1 h. The peptide, however, was found to bind also onto other normal cells and cancer cells. Therefore, an alternative screening method that discriminates different cancer cells was proposed. A preliminary result indicates that some peptides can discriminate cancer cells. The result was supported by confocal microscope observation of peptide/cancer cell mixtures.
 We designed and synthesized a novel near infrared fluorescence (NIRF) dye, IC7-1. To apply IC7-1 as a signal unit, we used a novel self-assembling polymeric micelle, lactosome, which is composed of poly(L-lactic acid)-block-poly(sarcosine) Lactosome can entrap hydrophobic molecules into hydrophobic inner core. The size of the molecular assemblies was controlled around 30 nm. Since the newly synthesized IC7-1 was highly hydrophobic molecules, it was successfully constructed by using lactosome which incorporated large amount of the fluorochromes. Quenching methods of IC7-1 were also examined to develop the pH-responsive NIRF probe. Quenching of NIRF was achieved by absorption of gold nanorod. Next, we encapsulated IC7-lactosome, into the liposome. It was shown that these liposomes also retained signal quenching activity as well as IC7-lactosome.
The tumor-targeting probes (anti-MT1-MMP and SLX) selected previously were properly conjugated on the surface of liposomes encapsulating IC7-lactosome. It was suggested that the molecular probes having both tumor targeting and signal quenching activities were constructed. When examined in vivo using tumor bearing mice, the newly developed NIRF probes were clearly visualized tumor in vivo.
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