成果報告書詳細
管理番号20110000000141
タイトル平成20年度~平成21年度成果報告書 健康安心イノベーションプログラム「分子イメージング機器研究開発プロジェクト/新規悪性腫瘍分子プローブの基盤技術開発/分子プローブ要素技術の開発」
公開日2011/5/3
報告書年度2008 - 2009
委託先名学校法人慈恵大学
プロジェクト番号P08029
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約「標的認識ユニットの開発、抗テネイシン抗体、抗TIF各抗体の腫瘍標的認識能の評価と抗体の安定大量産生への試み」を分担テーマとして研究を遂行した。我々が標的分子として選択したヒト癌胎児性間質蛋白質tenascin~C (TN~C) は細胞の移動や増殖にかかわる分子であり転移を示す高悪性度癌細胞には高発現する。そこで転移能が強い癌の非侵襲的な早期診断・治療を見据えTN~C分子の標的認識ユニット要素の標的分子としての有用性について検討した。まず、本研究の遂行上必須のTN~C発現ヒト癌細胞株の検索と分子発現環境の検討を行い、数種のヒト癌培養株で平板培養に比較して生体内組織を一部再現可能なスフェロイド培養と高密度大量培養に適したラジアルフロー型バイオリアクター(RFB)を用いた三次元立体培養での高発現がヒト腫瘍ヌードマウス移植組織と同様にin vitro培養系でも確認できた。このことはin vitro培養系を用いても細胞環境に注意を払う事で生体内環境での分子挙動を再現可能で、この結果、生体内でのイメージングにむけた標的分子としてのTN~Cの有用性が十分裏付けられた。ついで 蛍光色素標識修飾操作の抗ヒトTN~C抗体への安定性の影響について検討し 抗体力価は数%~数10%低下する抗体も認めた。同時に予後調査の確立した臨床腫瘍標本での検討からTN-C発現と腫瘍悪性度の高い相関関係を再確認出来た。ついで標的認識ユニットとして選択された有望な抗体を用い市販の近赤外蛍光色素並びに研究組織内研究開発で得られた新規近赤外蛍光色素を用い近赤外蛍光標識抗体を作製し、ヒト腫瘍移植動物への生体内投与で経時集積性と特異性をマトリックス細胞研究所、東京大学大学院薬学系研究科と共同で比較評価し標的認識ユニットとしての有効性を確認した。また有用抗体の大量産生に向け、精製に影響する培地中添加FBSの影響を排除し、精製の簡略化、迅速化に必須の無血清培地馴化抗ヒトTN~C抗体産生ハイブリドーマ2系統を樹立した。1系統は免疫ラット脾細胞/マウスミエローマのハイブリドーマ、もう1系統は免疫BDF1マウス脾細胞/マウスミエローマ由来のハイブリドーマである。この二株はともに融合パートナーの種の問題から常法のプリスタン注射BALB/cマウスには可移植性が無く、大量抗体産生には免疫不全マウスへの移植による抗体産生のみが可能なもので、しかもいずれも腹水化が極めて困難な系統であった。本樹立細胞株を用い、高密度大量培養に適したRFBを用いた培養系とBDCELLine CL~1000フラスコを用いた2種類の培養システムでハイブリドーマ大量培養法を確立できた。これらの培養システムを用いて1回の培養でハイブリドーマ移植マウスの腹水中抗体IgG量とほぼ同程度の10~20mgの機能の十分な抗体IgGを得ることが可能で、標的認識ユニットとしての抗ヒトTN~C抗体の大量供給に目処をつけた。
英文要約Title:R&D Project on Molecular Imaging Equipment/Development of Core Technology on Novel Molecular Imaging Probes for Malignant Tumor Detection/Development of Elemental Technology for Molecular Imaging Probes (FY2008-FY2009) Final Report
Earlier diagnosis and therapy is the most effective for cancer prevention. To establish the uninvasive and effective in vivo tumor detection system for small size lesion by molecular targeting/imaging methods, tenascin-C (TN-C), a molecule that functions as a promoter for tumor cell motility and metastasis and a prognosis predictable marker, was selected as the targeting molecule for cancer detection. Final goal of our study is to realize TN-C antibody-directed early cancer diagnosis with uninvasive in vivo detection. For this aim, usefulness of antibodies against human TN-C was first determined in several human cancer cell lines by immunocytology using the antibodies labeled with Alexa488, showing the focal distribution of intracellular TN-C fluorescence with intercellular fine depositions at rather pilling-up cells than those in monolayer sheet. A spheroid culture, a conventional 3D culture method, and a radial flow bioreactor (RFB), another 3D culture devise system, which provides tissue architecture and molecular function mimicking the in vivo environment, of A431 cells resulted in upregulation in TN-C mRNA and protein with simultaneous downregulation of E-cadherin and overexpression of vimentin, like epithelial-mesenchymal transition (EMT), with significant accumulation of TGFbeta1 in conditioned media. The sequential change of EMT related molecules was also recognized in tumor cells transplanted into nude mice. These results confirmed that the TN-C is a sufficient marker for cancer detection in in vivo environment. Clinicopathologic analysis in large panel of patients with human endometrial carcinoma also recognized the significant correlation with various histopathologic risk factors of cancer to TN-C expression.To select the suitable antibodies for in vivo imaging, whether the labeling procedures of fluorescence caused the reducing of TN-C antibody titers was first analyzed and the TN-C recognizing ability of several labeled antibodies decreased in approximately 10-30% compared to those of intact antibodies. Tissue distribution and tumor targeting ability of Alexa488 labeled anti TN-C antibodies was analyzed in tumor bearing nude mice. Significant elevation of tumor-blood ratio was detectable at 48 hours after administration of the conjugate. In in vivo imaging, anti TN-C antibodies coupled with infra-red fluorescence accumulated gradually and peaked at 48 hours after administration of the conjugates and the strongest fluorescent intensity was detectable. Enough fluorescence intensity for imaging was able to capture up to 7 days later. To supply a large quantity of antibodies, some antibodies-producing hybridomas were changed to proliferate under serum-free conditions, because of easy purification of the antibody. They produced approximate 10-20 mg of functionally active antibodies within 3 weeks of culture, by means of culturing methods using either BD CELLine CL-1000 flask or RFB.
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