成果報告書詳細
管理番号20110000000680
タイトル平成21年度~平成22年度成果報告書 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術開発) 疎水性イオン液体や耐塩性酵素を用いた前処理・糖化技術に関する研究開発
公開日2011/6/29
報告書年度2009 - 2010
委託先名国立大学法人鳥取大学 国立大学法人信州大学 出光興産株式会社
プロジェクト番号P07015
部署名新エネルギー部
和文要約1. 疎水性イオン液体の開発
 セルロース分子間の水素結合に割り込み可能な原子団を導入することでセルロース溶解性ILデザインを検討したところ、末端フッ素官能基を持つ4種の疎水性イオン液体が僅かにセルロース溶解性を示した。次にセルラーゼとセルロースの親和性に着目して、アミノ酸を対アニオンにもつイオン液体を合成しセルロース溶解性を調べた結果、N-2-メトキシエチル-N,N-ジエチル-N-メチルアンモニウム ([N221ME])アラニンが100℃、10分の処理で12wt%の微結晶セルロースを溶解し、結晶構造を完全にII型に変化させることがわかり、親水性であったが安価で安全性の高い新規イオン液体の開発に成功した。
2.耐塩性酵素の開発
 Pestalotiopsis由来の耐塩酵素Cel5Aを麹菌に形質転換し、その発現を確認するとともに生産されたタンパク質を純化し、その諸性質を明らかにした。さらに構造解析のために、結晶化を行い、結晶は得られたもののX線解析には不十分であったため、結晶化を続行している。また市販のイオン液体を用いて、セルロースを可溶化させる条件と、その後の酵素分解条件を最適化し、分解率80%以上で、1gの生成糖を得るために必要な酵素量が3.2mg(目標値10mg/g生成糖)あることを明らかにした。さらには、実バイオマスであるバガスを用いても、ほぼ目標値に近い分解率及び酵素使用量を達成した。特筆すべきは、鳥取大の開発した新規アミノ酸系イオン液体を用いることにより、上記以上の酵素糖化が行えることを明らかにしたことにある。
3.前処理・糖化プロセスの開発
 市販イオン液体の中で、試薬セルロースの溶解度が高いイオン液体として1-Ethyl-3-methylimidazolium acetateを選定した。同イオン液体を用いて、試薬セルロース20重量%相当の高溶解濃度条件においてセルロース結晶形態を1型から酵素糖化性の良い2型に変更できる操作条件を見出した。更に、溶解セルロースからイオン液体を回収する方法として、貧溶媒で溶解セルロースを析出させた後に、破砕、多段の温浴洗浄、更に減圧蒸留を用いる方法を開発した。同手法により、試薬セルロースのみならず、実バイオマスであるバガスについてもイオン液体回収率として、研究開発目標である97%以上を達成した。
英文要約Title: New Energy Technology Development / Development of Technology for High-efficiency Conversion of Biomass and Other Energy / R&D of Pretreatment and Saccharification Using Hydrophobic Ionic Liquid and/or Halotolerant Enzyme
(FY2009-2010) Final Report
(1) Development of hydrophobic ionic liquid that can dissolve cellulose
The efficient dissolution of cellulose is a long-standing goal in cellulose science and development of an appropriate liquid that can dissolve cellulose is a great important. We succeeded in developing a very economical and safety novel ionic liquids that show good dissolving power against cellulose, though it showed hydrophilic property. Our developed novel ionic liquid, N-(2-methoxyethyl),N,N-diethyl,N-methylammonium alanine ([N221ME][Ala]) dissolved 12 wt% of cellulose (Avicel) by the mixing at 100°C for 10 min and it was also found that the regenerated cellulose from this solution was only Type II form.
(2) Heterologous expression of halo-tolerant cellulase
Halo-tolerant cellulase Cel5A from Pestalotiopsis sp. was expressed in Aspergillus orysae successfully, and purified as homogeneous protein. Furthermore we have tried to crystallize it to analyze the protein structure, because Cel5A have the unique properties such as halo-tolerant and thermo-stability. Protein crystal of Cel5A was obtained but the crystallinity was not sufficient for X-ray analysis, so we continue to crystallize it.
(3) Enzymatic degradation of cellulosic biomass treated with ionic liquid
1-Ethyl-3-methylimidazolium acetate, [Emim]OAc can be solubilize the most amount of cellulose among the ionic liquid. Regenerated cellulose (RC) treated with [Emim]OAc showed the typical type II crystal form. RC was degraded by commercial cellulase preparation completely, and the enzyme used in this condition was 3.2 mg protein against 1 g of sugar from RC. Moreover new developed ionic liquid in this project, diethyl methyl ammonium alanine was evaluate as best solvent for cellulose solubilization among any ionic liquid developed till now and the RC with this ionic liquid was degraded completely as well. When baggasse was used as substrate, the target value (degradation rate: >80%, enzyme dosage : <10mg/g-sugar produced) was almost cleared.
(4) Reuse of ionic liquid for pretreatment
The reuse of ionic liquids is important for commercial processing of biomass, since the cost of ionic liquids is relatively high. Ionic liquid, 1-Ethyl-3-methylimidazolium acetate ([C2mim]OAc), was used to pretreat biomass (cellulose microcrystalline or sugarcane baggase). After pretreating, the biomass in [C2mim]OAC was precipitated with addition of water, crushed and washed with water. And, the recovered dilute [C2mim]OAc was purified by evaporation of water. The cycle from pretreatment to purification was repeated three times without decomposition of [C2mim]OAc. The recovery rate of IL for each cycle was more than the target value, 97%.
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