成果報告書詳細
管理番号20110000000902
タイトル平成21年度~平成22年度成果報告書 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術開発) 遺伝子組換え技術による新規なミスカンサス育種素材の創出
公開日2011/6/29
報告書年度2009 - 2010
委託先名国立大学法人北海道大学北方生物圏フィールド科学センター
プロジェクト番号P07015
部署名新エネルギー部
和文要約2008年3月に策定された「バイオ燃料技術革新計画」の実現に向け、バイオエタノール製造の増産が可能なセルロース系原料として、ミスカンサス(ススキ(Miscanthus)属植物)は、最も有望なエネルギー作物の一つである。最大バイオマスポテンシャルが50t/ha/年で、1) C4植物で、低温下での高い光合成能、2)生育サイクルの永続性、3)持続的で効率的な窒素やリンなどの栄養養分循環、4)高いエネルギー効率 (生産/投入)、5)地下部への炭素固定などの優れた特性があり、温帯から冷帯の地域、とりわけ寒冷地におけるバイオマス生産には非常に優れ、欧米でも期待度が高い。上記計画の2030年までのロードマップとして、遺伝子組換え技術による革新的なエネルギー作物の開発が盛り込まれている。そこで、本研究開発では、ミスカンサスにおける遺伝子組換え技術を確立するとともに有用な育種素材植物体の創出を検討した。第一に、世界に先駆けてミスカンサスにおける遺伝子組換え技術を確立できた。形質転換系技術を確立するために、ミスカンサスの代表的な植物であるススキ(Miscanthus sinensis)を用い、レポーター遺伝子に緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を使用した。開発のポイントは、全国から収集した豊富な遺伝資源の中に培養特性に優れる系統を見出したこと、ならびに、カルス培養、選抜、再分化の諸条件を最適化したことである。その系統由来のカルスを用いて、パーティクルガンを用いた形質転換法により、遺伝子組換え植物の作出を実現できた。第二に、牧草由来のフルクタン合成酵素遺伝子を導入したミスカンサス組換え植物体を創出できた。ミスカンサスは光合成同化産物を主としてデンプンに変換して葉緑体に貯蔵するため、フルクタン合成能力を持たない。寒地型イネ科牧草などでは、フルクタンを細胞内の液胞に蓄積し、この蓄積された水溶性多糖はエネルギー源として植物体の栄養生長に利用される。このため、フルクタン合成酵素遺伝子をミスカンサスに入れることにより、細胞内の糖含量やバイオマスの増加が期待できる。そのため、ペレニアルライグラスから単離したフルクタン合成酵素遺伝子の導入を検討した。6-SFT、6G-FFT遺伝子を組み込んだベクターを構築して導入を行い、形質転換植物体を得ることができた。これらの組換え個体で導入遺伝子の存在と発現を確認した。予備的な結果として、これらの組換え植物体は、低温条件下で、対照植物より生育が旺盛で耐寒性が向上し、糖組成に変化がみられた。第三にミスカンサスにおいてRNAi技術によるリグニン合成酵素遺伝子の発現抑制をカルスレベルで検証できた。ミスカンサスからリグニン合成酵素遺伝子(COMT、CCR、CAD)を単離し、RNAi用植物形質転換ベクターを構築して、ミスカンサスカルスへ導入を行い、形質転換カルスを得た。COMTおよびCCR遺伝子の形質転換カルスにおいて,それぞれの遺伝子について部分的に発現がみられるもの、全く発現のみられないカルスを観察できた。このため、カルスにおいてRNAi技術によるリグニン合成酵素遺伝子の発現抑制を検証できた。以上、ミスカンサスにおける遺伝子組換え技術を確立でき、実用遺伝子を導入した組換え個体を創出できた。残された問題として、フルクタン合成酵素遺伝子の組換え個体の詳細な特性評価ならびにRNAi技術によるリグニン合成酵素遺伝子の発現抑制した組換え植物体の作出と得られた植物体の特性評価、特にリグニンの定性、定量や糖化効率などの分析から、有用な育種素材を選抜することがあげられる。
英文要約Efforts are currently being made in connection with the Bio-fuel Technology Innovation Plan - an initiative developed in March 2008 by the Japanese government. Plants belonging to the genus Miscanthus are considered one of the most promising energy crops as a cellulosic feedstock material offering the potential for increased bioethanol production. Potential maximum biomass production of Miscanthus is 50t/ha/year and there are several advantages such as efficient C4 photosynthetic pathway, especially higher photosynthetic ability under low temperatures, perenniality, efficient nutrient recycling, high energy efficiency rate, and carbon sequestration in soil. Miscanthus is adaptable for temperate to cool regions, and it shows especially high biomass performance in cool regions. The above mentioned plan includes the importance of the development of transgenic energy crops as a road map for 2030. Thus we studied the development of a transformation system for molecular breeding. Firstly a particle bombardment - mediated gene transfer system was established using calli of Miscanthus sinensis. To our knowledge, it was the first report involving Miscanthus. The reporter gene was used for the green fluorescent protein (gfp). The key to this technology consists of selecting superior genotypes showing a good in vitro culture response and the optimization of in vitro culture, selection and regeneration conditions. Foreign genes were successfully delivered into M. sinensis calli by particle bombardment, and plants were subsequently regenerated, in which the expression of transgenes was confirmed. Secondly transgenic plants with fructosyltransferase (FT) genes were successfully obtained by particle bombardment - mediated transformation. Fructans, polymers of fructose, accumulate in plant cells as a carbohydrate reserve in addition to or instead of starch in temperate grasses. Miscanthus is a naturally non-fructan producing plant which accumulates starch as the storage carbohydrate. Fructan is synthesized by a combination of multiple FT genes. Delivery of FT genes into Miscanthus would be expected to increase sugar content and biomass potential. Transgenic plants with two FT genes (6-SFT and 6G-FFT) were regenerated respectively, in which the expression of FT genes was confirmed. The preliminary research revealed that transgenic plants showed a better performance than the control and a change of sugar components when they were grown under cool temperatures. Thirdly gene silencing of lignin biosynthesis genes by RNAi technology was confirmed in transgenic calli of Miscanthus. Three genes involving synthesis of lignin (COMT, CCR and CAD) were partially isolated from Miscanthus. RNAi vectors containing DNA of COMT, CCR and CAD were delivered into calli. Suppression of gene expression of lignin genes was observed in transformed calli. The newly developed gene transfer technology for Miscanthus is expected to create groundbreaking new varieties, such as types featuring improved saccharification by modification of the cell wall composition, and types with environmental stress tolerance. The creation of new breeding materials via genetic modification will allow for the development of novel energy crop varieties.
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