成果報告書詳細
管理番号20110000000999
タイトル平成20年度~平成22年度成果報告書 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術開発) 酵素糖化・効率的発酵に資する基盤研究~嫌気性細菌のセルロソーム形成機構を利用した人工セルロソームの研究開発~
公開日2011/6/29
報告書年度2008 - 2010
委託先名国立大学法人三重大学
プロジェクト番号P07015
部署名新エネルギー部
和文要約 セルロース系バイオマスの実用的な酵素糖化法の開発を目標として「新エネルギー技術研究開発/バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導研究開発)/酵素糖化・効率的発酵に資する基盤研究」が独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構の委託事業として平成20~24年度にかけて行われている。本委託事業は5つの開発項目・分科会(i.原料構造分科会ii.微生物・遺伝子探索分科会、iii.酵素糖化分科会、iv.発酵分科会、v.総合調整と調査研究)からなり、三重大学は、iiiの酵素糖化分科会に参加した。三重大学以外に、財団法人バイオインダストリー協会、長岡技術科学大学、大阪府立大学、岩手生物工学研究センター、農業生物資源研究所、食品総合研究所、明治製菓、花王、日揮、旭硝子、長瀬産業、天野エンザイムの各グループが参加した。三重大学グループはこれまでに嫌気性細菌のセルラーゼ系、特にセルラーゼ複合体の研究を行ってきたことから、「嫌気性細菌のセルロソーム形成機構を利用した人工セルロソームの研究開発」の課題で研究を行った。本研究で得られた成果は、将来の酵素能力の改善に有望ではあるが、本事業の目的である2015年の技術確立後に必要となる技術であるので、技術確立を優先するために本事業としての研究を終了することとなった。本報告書は、平成20~22年度に行った研究成果をまとめたものであり、他の酵素糖化分科会のグループに先んじて報告するものである。本研究で得られた成果は次のように要約される。
 本研究課題において、ファミリー3のCBM(CBM3)、C. josui由来コヘシン、C. thermocellum 由来のタイプ・およびタイプ・コヘシンからなるキメラ骨格タンパク質(mCip7)を作製した。また、各モジュール間に約30アミノ酸からなるリンカーを挿入したキメラ骨格タンパク質(mCip7L)も作製した。キメラ骨格タンパク質中のそれぞれのモジュールが正常に機能することを確かめた。一方、ドックリンを持つ天然型のセルラーゼの他、ドックリンを置換または付加したキメラセルラーゼを作製した。
 キメラ骨格タンパク質中のCBM3が正常に機能することを確かめた。また、キメラ骨格タンパク質中のコヘシンとセルラーゼ中のドックリンが結合することから、両者により、ミニセルロソームが構築されたと判断し、アビセルに対する酵素活性を測定した。その結果、様々なセルラーゼの組み合わせにおいて、セルラーゼの混合物に比べて複合体では数倍から十数倍の活性が見られ、セルロース分解における複合体形成の意義が証明された。また、CBM3を除去したキメラ骨格タンパク質を用いて複合体を形成した場合の相乗効果は、CBM3を持つ骨格タンパク質を用いた場合に比べて低かった。これらの結果は、セルロソームの強いセルロース分解力はCBMの効果とセルラーゼが近傍に存在することによる近接効果によるものであることを示した。 これらの結果は、複合体形成によりセルロース分解が飛躍的に高められること、セルロース分解におけるCBMの働きは一様ではなくCBM3の働きが強力であることを示唆した。複合体形成もCBM3も、本委託事業における研究の中心である糸状菌セルロース分解系には見られないものであるが、糸状菌の系に酵素複合体の概念を導入することにより、より強力なセルロース分解系を構築できる可能性を示した点で、極めて意義深いものである
英文要約Title: Basic Research & Development on Enzymatic Saccharification of Cellulosic Resources and Biofuel Production. Study on Construction of Artificial Cellulosome Based on Cellulosome Assembly Mechanism of Anaerobic Cellulolytic Bacteria (FY2008-FY2010) Final Report
In this study, we constructed a chimera scaffolding protein (mCip7) consisting of a family 3 carbohydrate-binding module (CBM3) derived from Clostridium thermocellum CipA, a cohesin module from Clostridium josui CipA (CjCoh), a type II cohesin module from C. thermocellum SdbA (Ct2Coh), and a type I cohesin module from C. thermocellum CipA (Ct1Coh), in the order from the N terminus. Since mCip7 does not contain a linker sequence between respective modules, another scaffolding protein (mCip7L) containing a linker sequence between respective modules was also constructed, in order to evaluate the necessity or unneccesity of linker sequences between respective modules. The mCip7 and mCip7L genes were expressed by an Escherichia coli strain BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL as the host. The chimera scaffolding proteins, mCip7 and mCip7L, were purified using a HisTrap HP column. Chimera cellulases containing a foreign dockerin module were produced using dockerin-fusion vectors, in which a dockerin module sequence of C. josui or C. thermocellum type I or type II was inserted between the multiple cloning site and the 6xHis-tag of pET-28a. Wild-type cellulases having a dockerin module were also produced.
When mCip7 and mCip7L were incubated with Avicel and then subjected to centrifugation, all most all proteins co-precipitated with cellulose, indicating that the CBMs in mCip7 and mCip7L had cellulose-binding ability. Interactions between scaffolding proteins and cellulases were confirmed by mobility shift assay on native polyacrylamide gel electrophoresis. These results suggested that mini-cellulosomes were formed from scaffolding proteins, mCip7 and mCip7L, and some cellulases. When hydrolytic activities toward Avicel of mini-cellulosomes consisting of mCip7 and various combinations of cellulases were compared with those of cellulase mixtures without mCip7, the formers were several times or more than ten times higher than the latters, clearly indicating the significance of cellulase complex formation for the construction of strong cellulolytic system. Cellulolytic activities of the mini-cellulosomes formed by mCip7 were quite similar to those by mCip7L, suggesting that the presence of linkers between respective modules is no important for cellulolytic activity of mini-cellulosomes. CBM3 in mCip7L was replaced by CBM1, CBM4 or CBM30, yielding mCip1L, mCip4L, and mCip30L. In addition, mCip7LN avoid of a CBM was also constructed. These scaffolding proteins were used for the formation of mini-cellulosomes and their activities toward Avicel were compared. As a result, we found that the cellulosome formed by mCip7L had the highest activity among various cellulosomes although mCip1L, mCip4L, and mCip30L had cellulose-binding ability. These results suggested that the strong activity of cellulosomes should be attributed to proximity effect and CBM effect.
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