本文へジャンプ

成果報告書詳細
管理番号20170000000872
タイトル平成25年度ー平成28年度成果報告書 バイオマスエネルギー技術研究開発 バイオ燃料製造の有用要素技術開発事業 可溶性糖質源培養による木質系バイオマス由来パルプ分解用酵素生産の研究開発
公開日2018/6/2
報告書年度2013 - 2016
委託先名株式会社Biomaterial in Tokyo 国立大学法人信州大学 国立研究開発法人森林総合研究所
プロジェクト番号P13011
部署名新エネルギー部
和文要約 セルロース系バイオマスを原料としたバイオエタノール製造はすでに実証段階に入っているが、糖化プロセスにおける糖化酵素コストが高く、製造コストの高騰要因になっており、安価で高活性な糖化酵素の生産技術開発が望まれている。本研究ではバイオエタノール商業化設備における使用酵素変動費について、6円/kg-発酵性糖以下のオンサイト酵素生産技術の確立を目指した。広葉樹晒クラフトパルプ(LBKP)をモデル基質として選定し、LBKPの酵素分解に最適な成分酵素組成のセルラーゼを生産する菌株として、可溶性糖質源培養が可能な糸状菌Trichoderma reesei M2-1及び分裂酵母Schizosaccharomyces pombeを使用することを特徴とする研究開発を実施した。
(1) 木質系バイオマス由来パルプに最適な成分酵素の探索・評価
 異なる可溶性糖組成の流加糖液で培養したベース酵素生産菌T. reesei M2-1の粗酵素を二次元電気泳動で解析し、そのタンパク質量とパルプ糖化性を評価した。LBKP糖化にはキシラン分解系酵素群が必要であることを明らかにし、キシラン分解系酵素群を生産誘導する為の流加糖液組成及び培養基材組成を明らかにした。さらに、LBKP糖化液にグルコースを加糖して調製する糖液を流加糖液として用いてもLBKP糖化に必要な成分酵素を誘導できることを明らかにした。
(2) 酵素生産力及び酵素性能の改良
 分裂酵母S. pombe発現系を用い、ベース酵素に不足するβ-グルコシダーゼ1、セロビオハイドロラーゼII、キシラナーゼ生産株を作製した。さらに、セロビオハイドロラーゼIIへの変異導入により熱安定性を向上させ、野生型の活性が10%程度に低下する条件において、変異体は約60%の残存活性を維持する変異酵素を取得した。また、ソホロース合成β-グルコシダーゼ(Cel1A)生産株の作製に成功し、変異導入により熱安定性とグルコース耐性を向上させ、変異導入前と比較してソホロース合成に必要な酵素量を1/32まで削減できることを明らかにした。
 β-グルコシダーゼ1生産株を用いた培養検討では、培養方法の最適化により事業開始時の2ー3倍程度の生産性向上に成功した。さらに、発現カセットの複数挿入により親株の3倍程度の生産性を示す改良株も取得した。製造コストは培養条件の検討により事業開始時の45%以下に削減させた。30Lジャースケールで生産したT. reesei M2-1ベース酵素とβ-グルコシダーゼ1との酵素カクテルでは、LBKPの酵素糖化において酵素変動費5円/kg発酵性糖以下を達成した。
(3) 可溶性糖質源培養による大規模酵素生産の技術開発
ベース酵素生産菌T. reesei M2-1、β-グルコシダーゼ1生産S. pombeともにミニジャーファーメンター検討時の活性を100%維持したまま30Lジャーファーメンターへのスケールアップに成功し、培養コストについてもそれぞれ事業開始時の15%、45%以下に削減した。ベース酵素の酵素活性は事業開始時の174%に向上しており、活性当たりのコストは事業開始時の8%以下にまで削減することに成功した。さらにベース酵素生産菌T. reesei M2-1について、培養規模を商用化設備規模に拡大するために、酸素移動容量係数KLaを指標にスケールアップ培養条件を設定し、2 kL容スケールにおいて、ミニジャーファーメンターを用いた実験室規模での酵素生産と同じ培養時間で同程度以上のタンパク質濃度、セルラーゼ活性濃度を有する酵素液を生産することに成功した。
英文要約Title: Bio-Energy Technology Development, Project on the Development of Useful Elemental Technology for Biofuel Production, Research and Development on Producing Woody-Biomass Pulp Degrading Enzymes by Microbial Cultivation on Soluble Sugars (FY2013 - FY2016) Final Report
Bioethanol production using cellulosic biomass as the feedstock is already a well-established process, but the cost of enzymes for the saccharification process is a significant factor for its high production costs, necessitating the need for cheap yet effective enzymes. This project focused on developing technology for on-site enzyme production to produce fermentable sugars at less than 6 yen/kg on a commercial scale. Filamentous fungi Trichoderma reesei M2-1 and fission yeast Schizosaccharomyces pombe were cultured with soluble sugars to produce enzyme components that were most effective in hydrolyzing LBKP pulp, the model substrate for this project.
(1) Search and Evaluation of Optimal Enzymes for Pulp from Woody Biomass
Feed solutions with various sugar composition were tested for culturing T. reesei M2-1 and the expressed enzymes were evaluated with 2D electrophoresis, protein concentration assays and pulp saccharification to determine the best sugar composition. The sugar solution also had to stimulate the production of xylan-degrading enzymes, which were found to be necessary for efficient LBKP saccharification of LBKP. Furthermore, the addition of glucose to saccharified LBKP solution was discovered to produce enzymes that further improved LBKP saccharification.
(2) Improvement of Enzyme Production and Activity
S. pombe was modified to express β-glucosidase 1, cellobiohydrolase II, and xylanase enzymes. The strain producing CBHII was further enhanced with heat tolerance, which allowed 60% of the original activity to remain in conditions where wild-type enzymes had less than 10%. Strains producing sophorose-synthesizing β-glucosidase (Cel1A) were modified with heat and glucose tolerance, and the enzymes needed for sophorose synthesis was reduced to 1/32 of the original requirement.
Cultivation methods for β-glucosidase 1 producing strains were also optimized to 2-3 times the original productivity, and the strains themselves were improved to be 3 times more productive, all while reducing the production cost by 45%. The enzyme cocktail of cellulase from T. reesei M2-1 cultivated in a 30 L jar and β-glucosidase 1 helped reduce the variable enzyme costs for saccarifying LBKP to less than 5 yen/kg of fermentable sugar
(3) Developing Methods of Mass Producing Enzymes Using Soluble Sugars
The cultivation of T. reesei M2-1 and β-glucosidase producing S. pombe were successfully scaled up to a 30 L jar fermenter while keeping the activities of the enzymes at 100% of the activities obtained in the small jar fermenters. Costs were also reduced to 15% and 45% of the initial costs respectively. Base enzyme activity increased by 174%, and production cost per unit activity fell below 8% of the initial cost. To further scale up the cultivation of T. reesei M2-1, the oxygen transfer rate (kLa) was used as an indicator for the trials at a 2 kL scale, which lead to higher protein concentration and cellulase activity within the same culture time as the lab trials.
ダウンロード成果報告書データベース(ユーザ登録必須)から、ダウンロードしてください。

▲トップに戻る